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(無題) 削除/引用 No.942-24 - 2012/11/23 (金) 21:34:26 - なでしこ組 >[Re:23] もるもろさんは書きました : > まともなトピックだったのにこの流れは残念ですね〜。 > どちらの方を取るわけではないが、作用が無いとの決めつけは危険でしょう。 それを言うなら、根拠も無いのに自明だなんていうのも問題でしょう。 間違った知識や概念がさぞ真実のように語られるのは、真面目にちゃんとした研究をしてる側からしたら大迷惑でしかないですからね。 そんなのを見ると黙っていられないんですよ。 検索用にPEIの“プロトンスポンジ効果”というポインターまで示してるわけだから、興味がある人は調べてもらえればいいんだけどね。

(無題) 削除/引用 No.942-23 - 2012/11/23 (金) 13:40:29 - もるもろ まともなトピックだったのにこの流れは残念ですね〜。 どちらの方を取るわけではないが、作用が無いとの決めつけは危険でしょう。 私の癖で他の人の言葉をそのまま借りるなら、（現実的かどうか何を根拠にいってらっせるか知りませんが、自分が信じた）現実的（だとする）な条件では少なくとも作用が無い。というだけのことでしょう。No.942-21の方が仰る通り、言葉の綾かもしれませんよ〜。 >[Re:20] なでしこ組さんは書きました : > > 科学の世界では、ないものをないと証明することは不可能ですよ。 > 科学の世界では、現実的な条件で作用が有るか無いかなんて、比較して試せば簡単に分かるし、 > 誰だって日常的にそうやって研究してるでしょう。 > 科学の世界での悪魔の証明とはどういうものか、調べてみたらいかがでしょう。 > > > クロロキン様作用があるのは自明のことです。ぜひ調べてみてください。 > 作用機序が異なるものを、クロロキン様作用がある、なんて言わないよ。 > 例えて言うなら、Triton X-100をがん細胞に撒いて細胞が死んだら、Triton X-100には抗がん剤様作用がある、って言うかな。 > > そもそも、自分の実験でも、PEIとクロロキンが相加的に働いて、作用機序が異なる事を示唆する結果が得られたんでしょ？ > > >

(無題) 削除/引用 No.942-22 - 2012/11/23 (金) 02:13:31 - おお >[Re:19] 774さんは書きました : > 調べてみたんですが、イマイチ理解できていません。 > クロロキンはリソソームの酸性化を抑制して分解を抑える。 > PEIは > １）pH緩衝能が高い。 > ２）リソソームを破壊する。 あ、具体的な話が上がってますね。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.942-21 - 2012/11/23 (金) 02:10:07 - おお あの、もし議論したいなら、実際のデーター(論文など)しめしていただけませんでしょうか。クロロキン様作用も、PEIの具体的にどの様な作用に対してそう言っているのか分からない(議論を見ている人は分からないですし、議論している人どうしで違うことを言っているのかもしれないですし)。 クロロキンはエンドソームのリソソームへの輸送阻害でしたっけ。PEIがその阻害作用を持っていなくても、リソソームへ行くまでにバーストしてしまうなら、結局はリソソームで消化されるのを防いでいるわけでしょうし(勝手な想像で書いてますので間違えであれば文献を示して教えてください)、それをクロロキん様作用と言っているなら、結局はそうは表現したくない、しても良いと思うの好みの問題になってくるようなきがしますし。

(無題) 削除/引用 No.942-20 - 2012/11/22 (木) 22:45:04 - なでしこ組 > 科学の世界では、ないものをないと証明することは不可能ですよ。 科学の世界では、現実的な条件で作用が有るか無いかなんて、比較して試せば簡単に分かるし、 誰だって日常的にそうやって研究してるでしょう。 科学の世界での悪魔の証明とはどういうものか、調べてみたらいかがでしょう。 > クロロキン様作用があるのは自明のことです。ぜひ調べてみてください。 作用機序が異なるものを、クロロキン様作用がある、なんて言わないよ。 例えて言うなら、Triton X-100をがん細胞に撒いて細胞が死んだら、Triton X-100には抗がん剤様作用がある、って言うかな。 そもそも、自分の実験でも、PEIとクロロキンが相加的に働いて、作用機序が異なる事を示唆する結果が得られたんでしょ？

(無題) 削除/引用 No.942-19 - 2012/11/22 (木) 17:25:31 - 774 ＞biochemさん、なでしこ組さん お礼が遅くなって済みません。 反応して頂きありがとうございました。 調べてみたんですが、イマイチ理解できていません。 クロロキンはリソソームの酸性化を抑制して分解を抑える。 PEIは １）pH緩衝能が高い。 ２）リソソームを破壊する。 のいずれかの機構でリソソームでの分解を抑制するという点で、 PEIはクロロキン様作用がある。ということでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.942-18 - 2012/11/21 (水) 00:25:21 - biochem なでしこ組さま 科学の世界では、ないものをないと証明することは不可能ですよ。 クロロキン様作用があるのは自明のことです。ぜひ調べてみてください。

(無題) 削除/引用 No.942-17 - 2012/11/20 (火) 12:23:50 - Atail なるほど、ありがとうございます。他にも文献を探してみましたが、凝集について記述された記録はかなり少ないように思います。本質的には問題にならないということでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.942-16 - 2012/11/18 (日) 16:22:53 - おお >[Re:15] Atailさんは書きました : > 293TにPEIでトランスフェクションしていますが、ハーベストした細胞がべたべたしています。PEIが核酸とともに細胞表層にたくさんくっついてしまっているのだと思いますが。 GEのPEIのトランスフェ句ションのせつめいにこんなのがありました。 >低カルシウム培地は凝集を減らし(4)、1%血清はトランスフェクション効率を改善します。 私の経験ではなく、そういう記述があったということで。。。 www.gelifesciences.co.jp/tech_support/manual/pdf/wave_06_01.pdf

(無題) 削除/引用 No.942-15 - 2012/11/18 (日) 14:59:07 - Atail 293TにPEIでトランスフェクションしていますが、ハーベストした細胞がべたべたしています。PEIが核酸とともに細胞表層にたくさんくっついてしまっているのだと思いますが。 lysateを作る際、おそらくこのべたべたが部分的に原因となって（バッファー組成や破砕方法の問題もありましたが）、発現させたタンパクの効率的な溶出が困難になったことがありました。このような経験をお持ちの方は他にいらっしゃいますでしょうか。解決策などをご教授いただければ幸いです。それとも、本来PEIでこのようなトラブルは起きないものなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.942-14 - 2012/11/18 (日) 12:43:16 - なでしこ組 > ”PEIにクロロキン様作用がある” ないでしょ。 形質転換効率を上げるという意味では同じでも、 クロロキンは小胞の融合を阻害することで働き、PEIはプロトンスポンジ効果で小胞を破裂させて働くんだからさあ。

(無題) 削除/引用 No.942-13 - 2012/11/18 (日) 03:28:15 - biochem 一般的なことのようですよ。 PEI. クロロキン.で検索してみてください。

(無題) 削除/引用 No.942-12 - 2012/11/17 (土) 13:50:40 - 774 ＞biochemさん ”PEIにクロロキン様作用がある” という点についてもっと知りたいのですが、 参考文献等をご存知でしたら教えて頂けないでしょうか？ 一般的な知識なのでしょうか？ 今更ですが、よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.942-11 - 2012/09/25 (火) 07:52:23 - おお 243でなくて293でした。

(無題) 削除/引用 No.942-10 - 2012/09/25 (火) 06:05:44 - おお 細胞腫243及び243T 243Tで共同研究しているラボが15ul(PEI)、3ugDNAを200ulserum free DMEMに加え、細胞(6well 2mlバイチ)に加えそのまま増殖させて、うまく行くという話を聞いてきて同じようにしましたが、毒性がでてしまったらしく6時間ぐらいでバイチを更新して実験をやるようになったそうなので、 243で同じようにして、バイチ更新抜きでやると同様に細胞がよわりました。無血清ばいちと増殖バイチ同時にやりましたが、無血清バイチでは若干毒性がつよくでました。トランスフェクション後バイチの更新も考えたのですが同じ割合でPEIの量を減らしていき5ul、7.5ulで細胞の調子を崩さずに(若干の増殖がよくせいされてます)トランスフェクションできることがわかりました。50%-60%の効率でもうちょっと何とかしたいなぁと思いましたので、レシオが大事と分かっていたのですが、その状態でDNAを3ug(つまりPEIは7.5ulのまま)でトランスフェクションしたところ、若干よい効率が得られたようにかんじました。 それで一応PEIを10ug入れっぱなしで培養してアタプテーションしてみましたが、それはストックをとったあとなにもしていません。

(無題) 削除/引用 No.942-9 - 2012/09/21 (金) 13:07:19 - biochem 細胞腫：HEK293T PEIとDNAの質量比：10:1（PEI 50 ug : DNA 5 ug in 2 ml） 培地：OPTI-MEM I transfection time：4-6 hrs 効率：-70% tips：PEI自身がpoly-L lysineのようなものとしても働くようで、transfectionした細胞が（lipofectamine2000を使用した時と比べて）剥がれにくい印象があります。HEKにはそれほどtipisはないですが、multiple lymphoma cell lineへのPEI transfection時にクロロキンを一定量加えると導入効率がかなりあがりました。PEI自身にクロロキン様作用があるにも関わらずクロロキンを添加で効率があがった理由はよくわかりませんが、B cell系ですのでantigen processing能が高い細胞なので、他の細胞以上にEndo/Lysoが発達しているのかなと推察しています。 参考になれば幸いです。

(無題) 削除/引用 No.942-8 - 2012/09/21 (金) 09:46:30 - もるもろ 私は、情報を持ち合わせていませんが レスポンスを含め、非常に良いトピックスですね。

(無題) 削除/引用 No.942-7 - 2012/09/21 (金) 02:54:44 - おお お示しの論文のひかくと自分のプロトコールをとおもったのですが、ちょっとでこんだことが出来る余裕がないので、、、

(無題) 削除/引用 No.942-6 - 2012/09/21 (金) 00:35:57 - Atail 一例です。参考になれば幸いです。 細胞：293T PEIとDNAの質量比：約3:1（18ug PEI + 5 ug DNA, 10cm dish） 培地：DMEM incubation time：10-15 min 効率：〜70%? tips：PEI/DNA溶液に加えるOpti-MEMの量を450uLと900uLとで比べたとき、前者の方が発現が良かったです。volumeが小さい方が効率が良いというのは他のトランスフェクション試薬にも共通したことでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.942-5 - 2012/09/19 (水) 14:29:14 - biochem2 論文も大体上がってきたので、そろそろ各自のprotocolを公開してもいいのではないでしょうか。 細胞腫： PEIとDNAの質量比： 培地： incubation time： 効率： tips： こんな感じでしょうか。

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