いつもいつも勉強させていただいています。
一月ほど前にも質問させてもらったのですが、その時にご回答いただいた先生方、心より感謝申し上げます。
ただ、やはり未だに格闘しています。もう無理かもしれないというところまで来ていますが、少し考えていることがあり、それをみなさんにお聞きしてもらえたらと思い、トピを立てました。
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菌株：SoluBL21
IPTG: 0.5 mM
Temperature: 30˚C
Time: 4 hrs
Media: M9 defined media
Volume: 1 L x 2
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Freeze and thaw x1
50 ug/ml Lysozyme
+ 1% Triton X100
+ 40 ug/ml DNase
+ 1 mM PMSF
in 20 mM Na phosphate buffer (pH 7.5)
1 hr, ゆっくり震盪、その後20,000xg, 10 min spin後の上清を可溶性画分とした
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0.5 ml Ni-beads
+ 20 mM Imidazole
4度で一晩ローテーション
20 mM Imidazole in phosphate bufferで洗浄後、500 mM Imidazole in phosphate bufferで溶出（5ml）
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20 mM Tris-HCl (pH8@25˚C)を5ml加え（2倍に希釈。）、0.5 ml分のGSH beadsを加え、6時間、4度でローテーション。
1000xg, 2 minでビーズを落とし、上清をアスピレートで吸引除去（＊この時、繊維のような紐のようなものが浮遊していることに気づきました。たぶんタンパク質だと思います...）
（A）←＊一月前に相談させていただいた内容です。
冷PBSで3回ほどビーズを洗浄し、適量のPBSに懸濁させたビーズをオープンカラムに移し、25 mM GSH in 50 mM Tris (pH 8)で溶出を試みましたが、たんぱく質は溶出されず、ビーズをSDSサンプルバッファーで処理すると目的のタンパク質ががっつり検出されました。（GSHビーズから溶出されない）
（B）冷PBSで3回ほどビーズを洗浄し、10ユニットのトロンビンをPBSに加え入れ、室温で16時間ゆっくり回転させました。結果は、上清にGSTが切断された目的のものが検出されることを期待しましたが、極わずかしか認められず、ビーズ側でGSTのバンドとGSTから切断されたバンドが検出されました。（つまりビーズ上でトロンビン切断されているけれど、ビーズから遊離されませんでした...）
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一体どうすればモノが得られるか、途方に暮れています。
ただ最近一つ気づいたことがあります。
私のタンパク質はシアル酸を認識するCタイプレクチンで、ある糖タンパク質（リガンド）を認識し、結合します。ただ最近になり、このCタイプレクチンはシス相互作用する報告がなされました。つまり、このCタイプ
レクチン同士で結合する、という報告がBIACOREの実験やカロリーメーターの実験などで証明されました。
そこで今考えていることは、GSHビーズ上で高濃度でタンパク質が集まるため、シス相互作用によりタンパク質凝集してしまったのではないか？と考えました。もしかしたら、GST精製の時点で遊離シアル酸を加えることでひょっとしたら上手に精製できるのではないか、凝集が抑えられるのではないかと考えました。
このようなことはうまくいくでしょうか？もし前例がありましたらシェアしていただけますと本当に嬉しいです...よろしくおねがいいたします。 |
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