全56件 ( 41 〜 56 )　 前 | 次 　1/ 1. 2. 3. /3

(無題) 削除/引用 No.7085-16 - 2018/08/08 (水) 09:40:43 - あくちの アダプターの問題でしたか。そういった失敗はデザインソフトを使えばほとんど無くせるでおすすめです。LICに対応したソフトも、無料から有料まで多数あります。自分もどこか抜けてるので、手作業で設計してたりするとreverse complementを忘れたりとかよくありました。

(無題) 削除/引用 No.7085-15 - 2018/08/08 (水) 01:18:21 - LIC おおさん、 ありがとうございます。 なにか新しいことを始めるといつもどこかで必ずミスをします。 本当に馬鹿ですね。時間の無駄。センスのかけらもないと自認しています。

(無題) 削除/引用 No.7085-14 - 2018/08/08 (水) 00:47:47 - おお あ、そうそう、デザインを一度冷静に（他の人に見てもらったりとか）見直すことも指摘しようと思ってました。

(無題) 削除/引用 No.7085-13 - 2018/08/08 (水) 00:39:19 - LIC すみません。PCRプライマーにつけるアダプターが逆相補的な配列となっておりました...ばかですね。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.7085-12 - 2018/08/08 (水) 00:09:27 - LIC やはりコロニーできていませんでした。 pET His6 MBP TEV LIC cloning vector (1M) (Plasmid #29656) これをaddgeneから購入しました。 プレートにリストリークして、コロニーをピックし、ミニプレップでプラスミドを調製しました。 これをSsp1（購入したばかり）で一時間、37℃で反応後、切り出し精製。 次にT4DNAポリメラーゼとｄGTP（終濃度10ｍM）で室温、30分反応させ、75℃、20分で酵素を失活させました。 一方、アダプター（addgeneの上の商品の下に書かれてあります。）を付けたプライマーでPCRし、切り出し精製。その後、T4DNAポリメラーゼとｄCTP（終濃度10ｍM）で室温、30分反応させ、75℃、20分で酵素を失活させました。 上記2つを適当な比率で混和し、5分室温の後、25ｍM　EDTAを加え5分室温インキュベート。 その後にトランスフォーメーションです。 結果、どのような比率でもコロニーは出ていません。 プレートにはカナマイシンをコートしています。アンピシリンではないことは確認しています。 もういっそ、DNAライゲースを混和液に投入すればいいのでは？と考えていますが、それでいけるでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.7085-11 - 2018/08/07 (火) 16:43:53 - おお ブラントなら末端のデザインしだいで何処にでもぶち込めると思うんだけどね。いざとなったらベクターもPCRしてLigationに持ち込めるし。 アドバイスをといっても、いろいろ基本的なことを含めてチェックポイントがありすぎますし、確認しづらいところもあるようなのでうまくいかないといわれても何を改善すべきか示せませんよね。 一つだけいえることはLigationしてませんのでTransformationの効率はたいていのLigationする系より低いはず。ということはコンピが結構しっかりしてないとクローんが拾えないかも。

(無題) 削除/引用 No.7085-10 - 2018/08/07 (火) 15:48:44 - LIC AAさん、APさん、 なるほどー制限酵素でのクローニングを想定しないベクターが増えているんだ... たしかに私の考えは古いのかもですね。 とりあえずコロニーがでるようにいのります( ・∇・)

(無題) 削除/引用 No.7085-9 - 2018/08/07 (火) 14:10:54 - AP いやもう、制限酵素を使うことを想定していないデザインのベクターも増えてきていますから。メリットも何もそれしか方法がない仕様ですから。そういう設計のものに制限酵素でクローニングできないなんてけしからん、なにかメリットが有るのか？、なんて文句文句始まらないのです。

(無題) 削除/引用 No.7085-8 - 2018/08/07 (火) 13:17:18 - AA InfusionにしろGibsonにしろ、制限酵素配列が選べないときや、 余計な配列を入れたくないときに、2断片のクローニングでもよく使うと思います。 大腸菌発現用ということですので、タグとかスペーサーとかの都合で 余計な配列をつけられないだけなのではないでしょうか？ なぜ、LICでやらなければいけないのかを理解できれば、 他の選択肢を取れるかどうか判断できると思います。 個人的には市販のシステムを買ってさっさと片付けるのをおすすめします。

(無題) 削除/引用 No.7085-7 - 2018/08/07 (火) 13:09:29 - LIC APさん、あくちのさん、 vectorに複数の PCR断片を一度にクローニングしたい場合には、ギブソンやらLICやらは有益だと思うのですが、今回はたった一つのPCR断片を大腸菌タンパク質発現用のempty plasmidにクローニングするだけなんです。 これをなぜLICでするのだ、、、とおもうわけで・・・

(無題) 削除/引用 No.7085-6 - 2018/08/07 (火) 11:52:36 - あくちの むしろ技術のいらない楽なシステムだと思います。

(無題) 削除/引用 No.7085-5 - 2018/08/07 (火) 10:50:57 - AP In-FusionとかGibson Assemblyとか、市販のシステムを使えば苦労しないけど。

(無題) 削除/引用 No.7085-4 - 2018/08/07 (火) 07:28:09 - LIC ligation independent cloningとの格闘に早一週間が経ちそうです。 Phusion　High-Fidelity DNA Polymeraseではうまく行かなかったです。もっともそれが原因がはわかりませんが。そしてT4DNAポリメラーゼを購入しまして、addgeneの指示どおりに処理し、形質転換させました。 まだコロニーは出てきていませんが、やはり思うのは、 LICって一体なんなんだろう？という疑問です。 一つのインサートをベクターにクローニングする際に、LICであるメリットってなんでしょうか？ 従来の制限酵素でのクローニングに比べ、下手したら時間も余計にかかる印象です。

(無題) 削除/引用 No.7085-3 - 2018/07/22 (日) 09:54:13 - LIC おお様、 お返事いただきありがとうございます。 ここでいう削り込みに必要な活性は3'exo活性ですよね。 dNTPが枯渇すると5’-3’伸長する必要がないので3'exo活性が優位になるという解釈でしょうか。 でしたら3'exo活性がT4ポリメラーゼに比べてもし仮に低くても、Phusion High-Fidelity DNA PolymeraseでもdNTP非存在下では末端の削り込みが期待できますね！ あまりLICでのクローニングのメリットが正直わかりませんが、一度やってみます！

(無題) 削除/引用 No.7085-2 - 2018/07/19 (木) 05:21:57 - おお たとえば、ライゲーションのために平滑末端を作るのにHigh-Fidelity DNA Polymeraseが代わりに使用されることがあります。そう考えるとできるんじゃないかなと想像します。 反応はそんな複雑でないしトランスフォーメーションも一晩で結果が見れるわけだからやってみるっていうのも手かなと思いますがどうでしょう。

ligation independent cloning (LIC) 削除/引用 No.7085-1 - 2018/07/19 (木) 05:04:08 - LIC 初めてトピックを立てさせてもらいました。よろしくお願いします。 私は制限酵素を利用したクローニングをこれまでたくさん行ってきましたが、ligation independent cloning (LIC)で遺伝子をプラスミドにクローニングする必要がでてきました。それはアドジーンから購入したエンプティプラスミドがそのような手段でしかクローニングができないからです。 原理は理解できましたが、ポリメラーゼについて質問があります。 私のラボには推奨とされるT4 DNA polymeraseはありません。 ただ次のチャートによるとPhusion® High-Fidelity DNA Polymeraseには、3′–>5′ Exonuclease活性があるようです。 neb.com/tools-and-resources/selection-charts/dna-polymerase-selection-chart 私の理解ではLICに必要なDNAポリメラーゼの特性は、3′–>5′ Exonuclease活性だと思うので、T4 DNA polymeraseをわざわざ購入することなく、無駄に高いですが研究室に在庫としてあるPhusion® High-Fidelity DNA Polymeraseを代用することは問題ないでしょうか？？ 大変初歩的な質問かもわかりませんが、周りに聞ける人がおりませんので、ここでトピックを立てさせていただきました。どうぞよろしくお願いいたします。

全56件 ( 41 〜 56 )　 前 | 次 　1/ 1. 2. 3. /3

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---