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解決しました 削除/引用 No.1599-11 - 2010/02/18 (木) 00:52:06 - スネーク しばらく放置してましたが、問題解決できました。 問題はアガロースのコンタミでした。どうやら、使用してたアガロースに微量のDNaseあるいは、Nicking enzymeがコンタミしていた模様です。 ちなみに使用してたアガロースはI社の汎用アガロース U○○○　Agaroseです。 もともとコンタミしていたのか、開封後にコンタミしたのかは不明です。 同様の問題でお困りの方がいらしたら、 Seakem等の信頼性の高いアガロースを使用することをお薦めします。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1599-10 - 2009/11/24 (火) 01:35:34 - スネーク ご指摘のとおり、前処理はvacuumでひきながらやっています。ちなみGEの説明書では、HClの処理時間は「BPBが黄色に変わるまで(約20分)」となっています。ゲルの厚さにもよると思いますが、30分はちょっと長すぎのようですね。次回は時間を短縮するか、HCl処理なしを試してみたいと思います。 それとキャピラリートランスファーも考慮に入れておきます。 それにしても、どうしてもスーパーコイルのみ消えてしまうのが理解できませんね。 とにかくアドバイスありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1599-9 - 2009/11/23 (月) 22:37:11 - AP 予想はずれでしたか。申し訳ない。 同じ5 ngでもリニアはOKなのにsupercoilがだめというのは説明しにくいんですが、ちょっと気になったことで、 >denatureについてですが、現在の転写法はＧＥのバキュームトランスファーを用いてHCl→denature→中和（各30分)→20XSSC(90分）です。 マニュアルどおりに、vacuumで引きながらdepurinationなどの前処理をしているのでしょうか。それともゲルを溶液に浸して前処理しているのでしょうか。 いずれにせよ、30分は長すぎではないでしょうか（vacuum blotterのマニュアルだと7分とか書いてませんか。私はBPBマーカーが完全に黄色になったら（大体10分以下）即、アルカリ処理に移ります）。分解されすぎて微量サンプルは検出限界以下になってしまうかもしれません。特にvacuumで引きながらだとブロットに適さない条件でtransferが進んでしまうのですっぽ抜けも起こりそうな（そういうこともあって、私はvacuumを使うときでも前処理は別にバットでやります）。vacuum blotterで30分というと、通常使うような1%以下、厚み5 mmくらいのゲルなら、transferは完了してしまうくらいですから。 前に言ったことと反しますが、depurinationはしないほうがいいかもしれません。分解によって感度を落とすので、サイズがかなり大きい、移動度の低い核酸で、どうしてもというのでなければやらないほうが安全です。 Vacuum blotは流速が速い分、transferが早くすみますが、条件がよくなければ、すっぽ抜けや、transfer不足を起こしやすいです。キャピラリーブロットのほうが、いい加減にやっても再現性が高いので、いっそのこと切り替えてみては。アルカリトランスファーでdownward のキャピラリーブロットすれば、2時間以下で完了しますので、時間的にはそんなに変わりません（私は、この方法を採用するようになってから、vacuum blotterはほとんど使っていません）。

追加のアドバイスをお願いします。 削除/引用 No.1599-5 - 2009/11/23 (月) 19:54:09 - スネーク ご教授いただいたとおりに、新規のdenature bufferを用いて、HCl処理(30分)後にアルカリトランスファーを行いましたが、前述の結果と同じ結果と同じでスーパーコイル相当のバンドのみ消失していました。現在、頭を抱えています。 何かほかに考えられることがあれば、追加のアドバイスをお願いいたします。

ありがとうございます。 削除/引用 No.1599-4 - 2009/11/20 (金) 19:55:53 - スネーク 早速のアドバイス非常にありがとうございます。 残念ながらメチレンブルーが手元にないので、トランスファーの確認ができません。しかしながら、スーパーコイル以外のバンドがキレイに検出できていること及びコントールＤＮＡの検出ができていることから、転写自体に大きな問題があるようには思えません。ハイブリは、うまく検出できていたときと同じ条件、同じ機器を使用しているので、原因ではなさそうです。ちなみに、違う種類のプローブも試してみましたが、同じ結果でした。 denatureについてですが、現在の転写法はＧＥのバキュームトランスファーを用いてHCl→denature→中和（各30分)→20XSSC(90分）です。次回は、新規のdenature bufferを作成して、アルカリトランスファーを試してみます。 重ねてありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1599-3 - 2009/11/20 (金) 19:39:07 - AP ヤマ勘です。 supercoilは一本鎖に解離しにくいので、denature処理が不十分でプローブがハイブリできなかった。 それまで出来ていて、急に出来なくなった理由 ・アルカリ変性は温度依存的なの寒くなってきた昨今、暖かい時期の条件では不十分になった。 ・変性溶液の調製間違い、保存中の変質（炭酸でpHが下がったとか）。 大量に乗せると見えるけれど微量だとsupercoilが選択的に消える理由。 ・変性が不十分でも大量に乗せればプローブがアクセスできる一本鎖が検出可能なくらいにはなるから。 もしそれが原因だというのが正しいとすれば、トランスファー法を、dupurination（HCl処理）後、アルカリトランスファーとすれば確実に解決すると思います。 アルカリ変性後、中和してSSCでトランスファーだと、部分的にsupercoilが解離したとしてもかなりrenatureするでしょう。この場合でも、depurinationをしてニックを入れれておけば、もはやsupercoilにはならないのでOKでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1599-2 - 2009/11/20 (金) 19:17:11 - あきら 非常に興味深い研究をされている様子で、 やったことがない実験ですが、 コメントさせていただきます． EtBrありなしをやっておられるみたいなので、 トランスファー以降に問題があるわけですよね？ メンブレンをメチレンブルーで染めたらどうなるでしょうか？ RNAでは良くやるんですが、トランスファーが うまくいってるかどうかが確認できると思います． トランスファーがうまくいってるなら、 ハイブリの問題ですよね？ ハイブリの条件検討で解決すると思います． トランスファーがうまくいってないとなると、 難しいですね． 電気的にトランスファーするとかになるんですかね？ 実験目的によっては、 別の系とかやる方がいいかもしれませんね． すみません、ありきたりなレスで．

プラスミド電気泳動 削除/引用 No.1599-1 - 2009/11/20 (金) 19:02:00 - スネーク いつも参考にさせていただいております。 最近おかなしな現象に悩まされているので皆様のお知恵をお借りしたいです。 出芽酵母からプラスミド(4.9 Kb)を回収し、0.5XTBE、0.8%アガロース(プラスマイナスEtBr)で泳動し、メンブレンに転写後、サザンでプラスミドのスーパーコイリング等を調べているのですが、ある日、突然スーパーコイルに相当するバンドのみ、かき消されたようになくなってしまいました。 考えられる原因をかたっぱしから調べてみましたが（コンタミ、バッファー組成、ローディングダイ、電圧、バッファーサーキュレーション）依然としてスーパーコイルのみ検出できません。 さらにおかしなことに、大腸菌から回収した同じプラスミドをコントロールとして流したところ、50ngロードすればスーパーコイルらしきバンドがスメアーに得られますが（サザンで検出するには過剰なため？）、5ngロードした場合はスーパーコイルのバンドのみ消えます。ちなみに、リニアライズしたプラスミドを5ngロードするとリニアーに相当するバンドがきれいに検出できます。 現在お手上げ状態です。アドバイスのほどよろしくお願いいたします。

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