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(無題) 削除/引用 No.2275-9 - 2010/03/22 (月) 23:48:57 - もんしろう >あべちゃんさん どうも貴重な情報をありがとうございました。おかげさまで安くウィルスを産生することができます。ラボの他の人にも教えて活用したいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2275-8 - 2010/03/21 (日) 23:44:36 - あべちゃん >[Re:7] もんしろうさんは書きました : > 　PEGを使った濃縮法とは、ウィルス産生した培地上清とPEGを混合して遠心にかければ良いんでしょうか？ 混ぜ方、大事です。HEPESが永遠に溶けなくなります。 Preparation of 4x PEG solution. 2.1Mark a line of 500 mL volume on a beaker or a flask. 2.2320 mL of 50% PEG 6,000 are prepared. 2.340 mL of 5M NaCl 2.420 mL of 1M HEPES 2.5Mix step 2.1 to 2.3 solution. 2.6Adjust the pH to 7.4 by NaOH (1M NaOH 5-10 mL) 2.7Fill up to the line of 500 mL by water. 上記の４ｘを作ったのち、ウイルスを含んだ培地（フィルターろ過済み）を３対４ｘPEG solutionを１で加えます。 丁寧にこのあと、4度でO/N（4度数時間でも可能） １５００ｇで4度30分 上清捨てる 再度１５００ｇで4度5分 ピペットで残液を丁寧に除去 好みのボリュームのOPTI-MEM（または低血清培地）で、優しくピペッティングで懸濁 −８０度で保存。 この保存ウイルスは少なくとも1年は十分に使えます。 ちなみに、私は、以下の文献を参考にしながら、カスタマイズしました。 Ann. Phytopath. Soc. Japan 40: 265-267 (1974) 下水からウイルスを濃縮する方法を記した論文です

(無題) 削除/引用 No.2275-7 - 2010/03/21 (日) 14:23:21 - もんしろう >あべちゃんさん 色々教えてくれてありがとうございます。 確かに私の書いた遠心法でウィルスを濃縮しようとすると、遠心機を占領してしまうことになりますね。 　PEGを使った濃縮法とは、ウィルス産生した培地上清とPEGを混合して遠心にかければ良いんでしょうか？よろしければ教えていただけますか？ それではよろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.2275-6 - 2010/03/21 (日) 01:55:39 - あべちゃん >[Re:4] もんしろうさんは書きました : > おっしゃる通りPEIを使ったtransfectionが安価なようなので、これを使ってウィルスを大量に調整して濃縮しようと思います。濃縮は超遠心を使わない遠心法(8000xg, 4℃, 16 h)が本に書いてあったので、これを使おうかなと思います。 PEG (polyethyleneglycol)を使えば、1500x g 4°C, 30 minで出来ます。 8000xg16hrは、実験医学別冊か何かに書いてあった方法ですね。 私もやってました。 ただ、遠心機を16時間もがめちゃうと気が引ける、頻繁には使えないので、私は何年か前に、PEGの方法に切り替えました。

(無題) 削除/引用 No.2275-5 - 2010/03/21 (日) 01:50:38 - あべちゃん >[Re:3] amiさんは書きました : > 横槍すいません。 > > > しかも最初に1万円投資すれば > > メーカーとかよろしければ教えてください。 Polyethylenimine “Max” 2g \22000ほど（有り余る量の溶液が調製できます） http://www.polysciences.com/Catalog/Department/Product/98/categoryId__283/productId__1960/ 自分のプロトコルちゃんと見ると1万じゃ足りなかったです。ごめんなさい。 でも、まず買い足す必要はないです。

どうもありがとうございます 削除/引用 No.2275-4 - 2010/03/21 (日) 01:14:03 - もんしろう あべちゃんさん 勉強になりました。どうもありがとうございます。 おっしゃる通りPEIを使ったtransfectionが安価なようなので、これを使ってウィルスを大量に調整して濃縮しようと思います。濃縮は超遠心を使わない遠心法(8000xg, 4℃, 16 h)が本に書いてあったので、これを使おうかなと思います。 どうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2275-3 - 2010/03/21 (日) 01:02:28 - ami 横槍すいません。 > しかも最初に1万円投資すれば メーカーとかよろしければ教えてください。

(無題) 削除/引用 No.2275-2 - 2010/03/21 (日) 00:48:14 - あべちゃん >[Re:1] もんしろうさんは書きました : > まず、レトロウィルスベクターをパッケージング細胞にtransfectionさせた後、ウィルスを回収します。そのウィルスを同種のパッケージング細胞に感染させることで高タイターのウィルスを作成することは可能でしょうか？ Stableを取ることは可能でしょうが、タイターが高くなるかは疑問です。 濃縮されてはどうでしょうか？ > ウィルスを使ってできるだけ多くの細胞（1dish内での感染効率のこと）に遺伝子を導入したいのですが、私の研究室は現在資金不足で Lipofectamine2000等の試薬を使ってパッケージング細胞にウィルスベクターを導入することができません。 PEIでトランスフェクションすると良いと思います。HEK293-baseの細胞であれば、ほぼ100％に近いトランスフェクションができ、しかも最初に1万円投資すれば、一生分のトランスフェクション試薬が作れます。 濃縮も、PEG-itのような高価なものを買わなくとも、安価な試薬でできます。

レトロウイルス作成について 削除/引用 No.2275-1 - 2010/03/20 (土) 23:45:52 - もんしろう いつも勉強させていただいております。 最近ウィルスを使った研究を始めたので質問させて頂きます。 まず、レトロウィルスベクターをパッケージング細胞にtransfectionさせた後、ウィルスを回収します。そのウィルスを同種のパッケージング細胞に感染させることで高タイターのウィルスを作成することは可能でしょうか？ ウィルスを使ってできるだけ多くの細胞（1dish内での感染効率のこと）に遺伝子を導入したいのですが、私の研究室は現在資金不足で Lipofectamine2000等の試薬を使ってパッケージング細胞にウィルスベクターを導入することができません。リン酸カルシウム法でも良いかと思ったのですが、上記の方法の方が高タイターのウィルスを産生することができるんじゃないかと思い質問しました。 それではよろしく御願いします。

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