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(無題) 削除/引用 No.245-8 - 2009/04/02 (木) 01:20:10 - Ficoll初心者 TＸ様、Tb様、mi様 ありがとうございます。 注射器、プラスチックピペット、パスツールピペットをそれぞれ試してみます。

(無題) 削除/引用 No.245-7 - 2009/04/01 (水) 14:17:13 - mi 骨髄や全血の単核球を回収するときには、１０ccのシリンジに、一般のものより長い注射針（ニプロカテラン針GAなど）を付けて回収しています。 針先を単核球の層に入れ、まんべんなく層の中をくるくる動かしながら吸い取ります。 ピペットが難しいようでしたら試してみてください。

10 mlピペット 削除/引用 No.245-6 - 2009/04/01 (水) 07:20:08 - Tb 50 mlのチューブで血球分離しているなら、10 mlのプラスチックピペット (with 電動ピペッター)がいいと思います。太いピペットの方が、界面の細胞をちゅるちゅる引き寄せるように吸えます。電動ピペッターは指の圧力が吸い込み速度に気持ちよく呼応するもので。Drummondのエアポンプと分離したタイプがおすすめです。

(無題) 削除/引用 No.245-5 - 2009/03/31 (火) 15:50:44 - TＸ リンパ球の分離は結構難しいですよね。 私も以前の講座でやっていました。 そこでは、先が欠けていないパスツールピペットを 電動ピペットに装着して採取していました。 チップを用いると口径が大きいのと吸い上げる力の調節が難しいので パスツールピペットよりも多くFicollを吸ってしまい 回収率が悪くなると考えます。 私の個人的な意見ですが、 回収率を高めるポイントは �@パスツールの先をFicollの層に入れない �AFicollまで吸い上げてしまうまたは境界面を乱すような力で回収しない �B欲張りすぎない ことだと考えます。 特に、最初は�Aの力加減が難しいです。 これは、数をこなして感覚をつかむしかないと思います �Bに関してですが、いったんFicoll層に混ざってしまった 単核球は回収しない方が無難です。逆に回収率が悪くなります。 うまくなると、 薄い膜しか単核球層が残らないようになります。 うまかった人は、パスチールで円を書くように 均等に単核球層を回収していました。 > また、うちのボスはFicoll後の遠心操作で細胞が落ちないのは、残留Ficollが邪魔するからと、３−４倍培地で希釈した後、遠心回転数と時間を増やして(2000rpm 20min.)細胞を沈澱させています。しかし私はその後培養するので、1200rpm程度で遠心するためPBSで多めに希釈しようと考えています。皆さんはFicoll溶液中の細胞をどのように回収されておりますか？ > > 不器用でお恥ずかしい限りですが、ご指導をお願いします。 細胞がダマにならない程度の遠心力で 時間を長くして遠心していました。 希釈倍率ですが、3−4倍の希釈倍率で十分です。 それ以上、希釈しても回収率は変わらないです。 私も、希釈倍率を上げれば落ちてくるかと考え、 希釈サンプルを遠心した際、浮いていた細胞の分画を 回収して再度培地で希釈し遠心したのですが 思うように落ちてきませんでした。 以上、参考になれば。

(無題) 削除/引用 No.245-3 - 2009/03/31 (火) 15:12:28 - Ficoll初心者 へまとろじすと様 教えて頂きありがとうございました。次回は電動ピペットを使ってみます。

(無題) 削除/引用 No.245-2 - 2009/03/31 (火) 13:39:19 - へまとろじすと 以前骨髄中のMNCを分離するためにやっていました。 その時の指導教官からは、ゆっくり吸うこと、少量ずつ回数をかけて回収するようにと言われていました。 個人的なやり方としては、ピペットの扱いが苦手なので、電動ピペッターにパスツールピペットをつけて回収していました。あと、個人的には血清の層が少ないほうがやりやすかったので、事前に吸い出していました。 細胞回収後は、5倍PBSでリンス、1500rpm 5分spin down、ペレットをセルバンカー溶かし-80℃で保存しています。 頑張ってください。

Ficollからの細胞の上手な吸い取り方 削除/引用 No.245-1 - 2009/03/28 (土) 10:45:12 - Ficoll初心者 こんにちは。 最近血液を扱うラボに入り、Ficollによるリンパ球の分離をしました。濃度の異なるFicollの重層と細胞分離までは順調だったのですが、トランスファーピペットの扱いが雑なのか、じわじわ吸っているつもりが界面を乱してしまい細胞を散らしてしまいました。その次にはフェノール抽出で慣れているからとピペットマンを使ったのですが、また失敗してしまいました。 自分の血液を多めに取って練習するしかないのでしょうか？ Ficollから細胞を上手に取るコツ、道具などありましたら教えてください。 また、うちのボスはFicoll後の遠心操作で細胞が落ちないのは、残留Ficollが邪魔するからと、３−４倍培地で希釈した後、遠心回転数と時間を増やして(2000rpm 20min.)細胞を沈澱させています。しかし私はその後培養するので、1200rpm程度で遠心するためPBSで多めに希釈しようと考えています。皆さんはFicoll溶液中の細胞をどのように回収されておりますか？ 不器用でお恥ずかしい限りですが、ご指導をお願いします。

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