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培養条件 削除/引用 No.2599-2 - 2010/07/10 (土) 01:03:25 - 経験者 既に解決されてるかも知れませんが、ご参考までに。 私も、いくつかBrevibacillus発現システムで発現を試みました。 上手く行ったもの（構造解析まで可能なレベル）も、行かなかったもの（コロニー自体が得られない、コロニーが得られても発現しないor抗体でやっと確認できるレベル）もありました。 バリボ命さんと同様に、初めての発現チェックの時に、BLAが発現しなかったのですが、幸いなことに目的のタンパク質は発現したので、BLAについては特に追求せず、自分の試料に専念しました。 いくつかやっていくうちに感じたことですが、どうも培養に用いる容器のサイズ、エアレーションの程度が、かなり効いているように思います。 これまでの経験では、エアレーションを下げた方が良い傾向にありました。 �@：私の経験では、どのコロニーでも、発現量に違いがあるということはありませんでした。 �A：これについては経験がないのですが、突っついたコロニーに、本当にプラスミドが入っているかどうか、コロニーダイレクトPCRで確認された方がいいかと思います（大腸菌と同様の方法で行えます）。抗生物質でセレクトされているので、プラスミドは入っているはずなのですが、念のため。 �B：培養条件が合ってないだけかも知れませんので、TCA沈殿などで濃縮してみることをお勧めします。私の経験ですが、うっすら発現していたものを、培養条件検討によって、1L培養で約10 mg程度の精製タンパク質を得ることが出来ました。 �C：グリセロール入LBで、グリストは作成できます（マニュアル通り）。ただし、同じストック容器を使って数回培養すると、発現量が激減します。ですので、グリストは少量に小分けして、使い切りとした方がいいです。 �D：マニュアルの通りに作成すると、効率は市販品よりかなり落ちましたが、可能でした（10^3-4/ug DNA程度：私がヘタだけかも。。）。あまりOD値に拘らず、対数増殖期が終わる前後あたりで、集菌するのが良いようですが、早すぎても遅すぎても、効率は激減するようです。あと、菌を懸濁するPGH溶液は、使用する当日に調製し、懸濁はなるべく穏やかにした方が、良かったです。 �E上手く形質転換ができなかったものについては、色々とプラスミドの条件（濃度・精製法・添加量）を変えてみましたが、あまり効果がないようでした。ただ、複数回形質転換を試みて、またエレポ直後の培養時間を2-3時間にしてみたところ、ある日、1-2個のコロニーが得られて、発現出来たことも一度だけありました。形質転換効率が低いだけのこともあるような気もします。何度もトライしても、コロニーが得られない場合は、この菌での発現が向いていないと考えた方が良いかも知れません。 それと、これはPichiaでもあった現象なのですが、野生型だと形質転換も問題なく出来て発現もするのに、その変異体については全く形質転換出来なかったことが、何度かありました。DNA配列にも何か影響を受けているのでしょうかね？謎です。。。 その他、培地ですが、CaやMgなどの二価カチオンも発現に効くようです。私の場合は、二価カチオンが無い方が発現には良かったです。またLBでも、低レベルですが発現しました。培地によって、発現の程度もかなり変わる場合がありますので、色々と検討した方がいいでしょう。 この発現系は、日本産ですので、これから発展して貰いたいと個人的には思っています。 Pichia程クセは無く、Pichiaで発現出来なかったものも発現したこともありましたので、もっと経験・情報が増えると、さらに発展するのではないでしょうかね。

ブレビバチルス(Brevibacillus)タンパク質発現系について 削除/引用 No.2599-1 - 2010/05/20 (木) 12:07:25 - バリボ命 TaKaRaのBrevibacillus Expression systemを用いて、タンパク発現に挑戦しえおりますが、中々うまくいきません。 もちろん目的とするタンパク質はあるのですが、現状ポジコンのpNCMO2-BLA DNAの発現すらできていないので、ここから解決したいと思っています。 方法は基本メーカーのプロトコールにのっとっています。 エレポ(Gene pulserII)してMTNmプレートに蒔き、37℃でO/Nで培養。 →コロニーをピックアップして、TM液体培地で72時間培養(30℃, 200rpm, ロータリーシェーカー) 上清、pptとも、CBB染色をしてもα-アミラーゼの発現が確認できません。 今疑問・問題になっている点として、 �@ポジコンであっても、10とか20コロニーつつく必要があるのか(普段2コロニー程度) �Aポジコンであっても、液体培地で培養すると菌体が増えてこないことが結構ある(今回は2個つついて、1個は全く菌が増えず) �B小スケール培養後の、上清での発現チェックでも濃縮は必要か（今は未濃縮） �C一度大量に増えるコロニーが得られればグリセロールストックなどは可能か �DBrevibacillusのコンピテントセルをラボで作製するのは可能か？ （普段大腸菌のコンピはラボで作製し、8乗程度にはなっているので、設備・技術的には問題ありません。） �Eプラスミドの精製度は大腸菌よりもシビアに効いてくるか （普段はカラム精製でプレップしたのみで、フェノクロ抽出などは行っていません） ※ポジコンは購入した原液を使っているので、�Eの疑問とは関係ありません �Fその他、培地などに工夫されていたらおしえていただけますでしょうか？ （現在はメーカー推奨のMTNmおよびTMNmを自作しています） ルーチンでBrevibacillusを動かしているかたがおられましたら、 アドバイスをお願いいたします。

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