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UVでしょうか 削除/引用 No.2663-9 - 2010/06/12 (土) 00:31:06 - はまじ 私も他の方がご指摘されているようにUVの可能性が非常に高いと思います。インサートによってはUVを当てても大丈夫だったので、UVの可能性を考えずに実験をして随分時間をロストしてしまった経験があります。つまり、そのインサートはUVを照射しないで回収しただけであっさりクローニングが行きました。 私は現在、切り出すDNAを分子量マーカーとともに電気泳動後、真っ二つに切ってしまいます。分子量マーカーと、ほんのかけらの部分の切り出すバンドを含んだゲルはUVで確認する用、残りの部分を切り出しに使用します。UV確認時に切り出したいバンドの位置にナイフなどで切り込みを入れて、それを参考にブラインドで残りの部分を切り出すと言うことになります。初めにやるときには不安いっぱいだったのですが、以前より当たりを引く確率は上がった実感があります。 過去のトピックなどを見てもUVを指摘される方が多いです。それほど面倒なことではないので、良かったら是非一度試してみてください。

(無題) 削除/引用 No.2663-8 - 2010/06/11 (金) 09:19:22 - PDI ベクターを50ngに固定、インサートをモル比3〜10程度に振り、total10マイクロLの系でligationしてみて下さい。 トランスフォーメーションには３マイクロＬ程度を使えば、まず前面にコロニーが形成されるはずです。 また、インサートによってはＵＶに弱い可能性もあるので、MupidBlue等で染色して切り出す方法もあります。

ああああさん 削除/引用 No.2663-7 - 2010/06/10 (木) 13:37:52 - あんず バックは取ってありますが、コロニーは０個で、私の現状は３番にあてはまると思います。 インサートとベクターはライゲーションの際、少ない方が良いんでしょうか？ てっきり私はインサートとベクターが出会う回数が多い方が良いと思って濃い目に作成してライゲーションにもっていってるんですが。。。 とりあえず、BAP処理をせずに行ってみます！！

(無題) 削除/引用 No.2663-6 - 2010/06/10 (木) 13:33:19 - あんず 他の人もEcoR Vを使用していて問題はないみたいなので、失活は考えにくいと思います。 自作の大腸菌も、同じく他の人が問題なく使用されているので大丈夫かと。。。 あと、こちらのミスで詳しく書いていなかったのですが、ライゲーションは先日記載したvolumeで行っていますが、トランスフォーメーションはこのmixtureの半分の量を用いています。

(無題) 削除/引用 No.2663-5 - 2010/06/09 (水) 17:50:32 - ああああ Nde IとEcoR Vで2cutしているならBAP処理は必要ないです。 BAPは失活させにくいので、少しでも活性が残っていたらライゲーション中にインサートも脱リン酸されてしまいます。カラムを通しているということなので、除タンパクはできているはずですが。 ベクターとインサートの量が多すぎませんか？ ライゲーションにはベクターが10ngくらいあれば十分です。 コントロールは取ってますか？ 以下の2つをトランスフォーメーションすれば、原因がわかると思います。 �@ベクターのみライゲーション �Aベクター＋インサート、ライゲーション �@コロニー0〜数個、�Aコロニーたくさんが理想です。 �@コロニーたくさんだと切れ残りがあります。 �@コロニー0〜数個、�Aコロニー0〜数個だとBAPが失活出来ていないか、インサートに問題ありです。

(無題) 削除/引用 No.2663-4 - 2010/06/09 (水) 16:27:17 - ~ 気になった部分については書かれている限りは問題ないようですね。 インサート入りのTベクターは、NdeI、EcoRVのそれぞれ単独で切れば、1cutになるのですか？ EcoRVサイトが死んでいて、NdeIサイトがインサートとベクターのもので切れれば、長さでは確認できない両末端がNdeIのインサートが出来ると思います。 自作の大腸菌のタイターに問題はありませんか？ 7uLのライゲーション産物を80uLの大腸菌にトランスフォーメーションするのは、持ち込み量としては上限に近いと思います。 持ち込み量を半分以下に減らしても改善しませんか？ ベクター：インサートの比率を変えることで改善する場合はあります。

ご親切にありがとうございます。 削除/引用 No.2663-3 - 2010/06/09 (水) 14:35:01 - あんず 私が全く条件も書かずに質問してしまい、本当に申し訳ありません。 まず一つ目に書いて下さったことについてですが、 1.切り出しというのは、アガロースゲルなどで電気泳動をして、そこから切り出しているという意味ですか？それとも、制限酵素で切っただけですか？ Ａ.アガロースゲル電気泳動を行って、そこから目的のサイズに一致するバンドを切り出しました。 2.ゲルから切り出しているのであれば、貴方はゲルからの切り出し→ライゲーション→トランスフォーメーションがちゃんと出来ますか？ベクターもインサートも長いので、UVのダメージが心配です。 Ａ.UVについてですが、私は以前にも同じ操作でpETDuet-1ベクターに遺伝子を導入できた経験を持っております。UVについても先輩方から注意するよう言われたので照射時間には気を使いなるべく短時間で操作しているつもりです。 3.ゲルＭキットとはどのメーカーのどの製品のことでしょうか？濃縮と一緒にBAPを除くことが出来るキットなのですか？ Ａ.商品名はGel-M Gel Extraction System(VIOGENE社) なんですが、今ホームページを見るとこの商品名はなく、似たようなもので、Viogene® Gel/PCR DNA Isolation System というものがありました。教授から、Gel-M を使えば濃縮が簡単にできると教わったのでこの方法を用いましたが、BAP処理をした後はみなさんBAPを取り除く操作をしていらっしゃるのでしょうか。うちの研究室では取り除く操作は行っていません。インサートが入りづらかったら濃縮をするなどしているのみです。 4.どのTベクターか分かりませんが、pGME-TeasyだとするとEcoRVサイトは残ってなく、NdeIサイトが1個あります。そのため、どのサイトを使って切り出せているのかが分かりません。インサートはどうやって調整したどのような制限酵素サイトを持つ配列なのですか？ Ａ.pGEM-Teasy を用いました。インサートはNde I/EcoR V のプライマーを用いてPCRで増幅させ、ベクターに導入しました。インサートに２つの制限酵素サイトを付けたので、切り出せていると思うのですが。。。 5.ライゲーションハイがトランスフォーメーション時に悪さすることは分かっていますが、実際にトランスフォーメーションに用いた大腸菌量が書かれていませんので、貴方の使用量が適切なのかが分かりません。 Ａ.大腸菌量は約70マイクロです。うちの研究室で培養して作製したものなので、正確ではありません。 追記 どこかの操作でインサートもしくはベクターを失ってしまったのかもしれないと考え、制限酵素処理を行い濃縮したインサート及びBAP処理後に濃縮したベクターをアガロースゲル電気泳動を行い存在確認を行ったところ、目的の位置にバンドが確認できました。 全く情報の少ない質問に対して、わざわざ回答していただきありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.2663-2 - 2010/06/01 (火) 16:42:18 - ~ 操作の内容がライゲーションの条件以外あまり書かれていないので、 問題の"無い"部分があるかどうかが分からないのですが。 なぜ、ライゲーションが怪しいとにらんで、詳しい組成を出したのでしょうか？ このサイトの質問では、ベクター、インサートの調整部分が一番トラブルが多いと思います。 １．切り出しというのは、アガロースゲルなどで電気泳動をして、そこから切り出しているという意味ですか？それとも、制限酵素で切っただけですか？ ２．ゲルから切り出しているのであれば、貴方はゲルからの切り出し→ライゲーション→トランスフォーメーションがちゃんと出来ますか？ベクターもインサートも長いので、UVのダメージが心配です。 ３．ゲルＭキットとはどのメーカーのどの製品のことでしょうか？濃縮と一緒にBAPを除くことが出来るキットなのですか？ ４．どのTベクターか分かりませんが、pGME-TeasyだとするとEcoRVサイトは残ってなく、NdeIサイトが1個あります。そのため、どのサイトを使って切り出せているのかが分かりません。インサートはどうやって調整したどのような制限酵素サイトを持つ配列なのですか？ ５．ライゲーションハイがトランスフォーメーション時に悪さすることは分かっていますが、実際にトランスフォーメーションに用いた大腸菌量が書かれていませんので、貴方の使用量が適切なのかが分かりません。

pETDuet-1 への導入 削除/引用 No.2663-1 - 2010/06/01 (火) 15:49:15 - あんず 現在、pETDuet-1 のマルチクローニングサイト２ (Nde I/EcoR V) にインサート (約1,400 bp) を導入しようとしているのですが、コロニーが全く生えません。空ベクターで同じように実験したところ、生えました。また、制限酵素処理が奇麗に行われていないためではないかとも考え、インサートの方は一旦 Tベクターに導入して切りだして精製しました。 教授の教えで、BAP 処理後のベクターをゲルＭキットを用いて濃縮し、ベクター：インサート＝１：３ くらいで行っています。条件としては、４℃で一晩ライゲーションした後に DH5α にトランスフォーメーションしています。また、ライゲーションハイが多いと阻害することがあると聞いたので、 ベクター 1マイクロ インサート 3.5マイクロ ライゲーションハイ 3.5マイクロ 用いています。 他の人はうまくいっているので、ライゲーションハイの失活でもないようです。 なにか問題点はありますでしょうか。 拙い文章ですみません。

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