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(無題) 削除/引用 No.2699-11 - 2010/06/09 (水) 21:41:30 - ma みなさま、たくさんアドバイスいただきありがとうございます。 >中年さん そうですね、私も他のタンパクでそういう経験があります。 >ああああさん、 先ほどでた結果ですが、一応アフィ二ティー精製した抗体で内在性のものが検出できました。 モノの確認は、ノックダウンでバンドが消えました。しかしシグナルは弱いです。 発現系のコンストラクトは、FlagかGFPを付けていますが、どちらもウエスタンや蛍光は確認できていません。 なので今のところは発現系がうまくワークしていないのではと考えています。 ＞実体験ですが、修飾されて200KDa以上になるタンパク質でHAタグだとウエスタンで検出でき＞るけど、GFPを融合させても光らないものはありました。 やはりGFPの方が難しそうですね。 ＞masaさん ＞SDS-PAGEのバッファーの組成でトランスファーを行うと高分子のタンパク質のトランスファー＞の効率が改善します（p300はこれでWBで検出出来るようになりました） これは知りませんでした。ウエスタンの効率が上がるかもしれません。 是非試してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2699-10 - 2010/06/09 (水) 19:56:09 - masa 私が扱っている遺伝子も200kDa程度あります。WB検出化ですがGFP融合させても蛍光は観察できませんでした。 p300とかさらに大きなタンパク質だとWBの際のメンブレンへのトランスファー効率がかなり悪くなるみたいです。 SDS-PAGEのバッファーの組成でトランスファーを行うと高分子のタンパク質のトランスファーの効率が改善します（p300はこれでWBで検出出来るようになりました）

(無題) 削除/引用 No.2699-9 - 2010/06/09 (水) 18:48:55 - ああああ タンパク質の性質によると思います。 ウエスタンで検出できないのは、抽出できていないだけなのでは？ タグは付けているのですか？ 抗体はきちんとワークしていますか？ 実体験ですが、修飾されて200KDa以上になるタンパク質でHAタグだとウエスタンで検出できるけど、GFPを融合させても光らないものはありました。

(無題) 削除/引用 No.2699-8 - 2010/06/09 (水) 18:26:39 - 中年 高発現が細胞にとってtoxicで、見かけ上のトランスフェクション効率（発現効率）が低くなっている可能性もありますね。

(無題) 削除/引用 No.2699-7 - 2010/06/09 (水) 15:44:27 - ma >中年さん アドバイスありがとうございます。 そうですね、CAGプロモータは試したいとおもいます。 おっしゃる通りウェスタンももう少し検討したいと思います。 確かに293Tならもう少し良さそうですね。これも試してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2699-6 - 2010/06/09 (水) 13:47:50 - 中年 293細胞、Lipofectamine2000、CMVプロモーターならかなり強力な組み合わせですね。CAGプロモーターは試してみる価値があるかもしれません。 GFP融合タンパク質の蛍光はウェスタンとは比較にならないくらい低感度なので、これがぱっと見、はっきり見えないのは仕方がないと思います。まずはウェスタンの条件検討かなぁ。 ポジコンのつもりで一度293T細胞にトランスフェクションしてみては？

(無題) 削除/引用 No.2699-5 - 2010/06/08 (火) 19:29:15 - ma >中年さん ２９３細胞になります。 Lipofectame2000によるリポフェクションです。 同時に実験した空のGFPは効率よく発現していたので（９割に蛍光）、 条件は悪くないかなと判断しています。 DNAの精製度も、他のコンストラクトと同じ条件なので、 問題はないかなと考えています。

(無題) 削除/引用 No.2699-4 - 2010/06/08 (火) 19:23:24 - 中年 細胞は何で、トランスフェクション方法はどうやってますか。

(無題) 削除/引用 No.2699-3 - 2010/06/08 (火) 19:10:45 - ma >こう＠免疫屋 さん ご助言ありがとうございました。 CAGプロモータのベクターならあるのですが、EF-1やubcは今持ち合わせていない状況です。 強力なプロモータなら多く発現するかもしれません。 コンストラクトのシークエンスは確認しました。

(無題) 削除/引用 No.2699-2 - 2010/06/08 (火) 15:46:04 - こう＠免疫屋 pEFなどはいかがでしょう？ こちらでは発現が弱い場合にEF-1αやUbCプロモーターを有するもので対処しています． もっとよい方法もあるでしょうが，一般的に発現が強いとされる部類ですのでうちの場合まずはこれで． 導入する細胞との相性もあると思うので，確実かと言われると困りますが． あとインサートは適切に導入されていますか？

高分子量タンパク質の発現 削除/引用 No.2699-1 - 2010/06/08 (火) 13:16:24 - ma いつもお世話になっています。 現在２００KDa以上のタンパク質について研究を行っているのですが、 pcDNA3やpEGFPなどのベクターを細胞にトランスフェクションしても 発現が認められません。 (ウエスタン、GFPの蛍光で検討) 論文等を見ると、例えばミオシンのようなタンパク質でも 普通にpcDNAに組み込んで発現を確認しているのもありますが、 私の扱っているのはどうやらだめみたいです。 ウエスタンの条件等他の可能性も残っているのはもちろんですが、 このような高分子量タンパク質を効率よく細胞等に発現する方法を何かご存知であれば、 ご教授いただけると幸いです。

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