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(無題) 削除/引用 No.2700-36 - 2010/06/11 (金) 19:19:10 - プレクリアー 2700-19です。 A 通常の免疫沈降と同等のバンドが検出されてしまいました。 B 通常の免疫沈降と同等のバンドが（目的タンパク質近傍に）検出されてしまいました。 個人的にはBは拡大解釈しすぎだと思います。いづれにせよ、場合分けして考えればいいことで、専門家が悩むことではありません。これは質問者が補足しないからで、ここではよくある無責任な行為です。もう出てくるに出てこれないのでしょう。 Aの解釈だと、単純に実験手法の問題ということで、いくつも指摘があるように、非常に初歩的なミスを犯しており（ふつうのコントロールを取っていない）、これも専門家がズルズル議論することではありません。

国語の問題として 削除/引用 No.2700-35 - 2010/06/11 (金) 17:28:17 - IP-WB 非特異的（目的タンパク以外）なものという意味であれば、 「抗体を入れて免疫沈降した時に、抗体を入れていない時に出てくるバンドが見える。」 非特異的（目的タンパク）なものという意味であれば、 「抗体を入れていない時に、抗体を入れて免疫沈降した時に出てくるバンドが見える。」 となりますかね。

(無題) 削除/引用 No.2700-34 - 2010/06/11 (金) 17:20:17 - 千夏 レフトさん 私はレフトさん（もちろん他の人も）の国語力がないと言っているんでなく、解釈が難しいという意味で難解な国語の問題だと言っているんですが・・・ 他の人の言葉を借りれば、スレ主の『同等のバンド』という表現がいまいち私らには分かりにくいでしょ？（名無しさんNo2700-23)。正直わたしもスレ主が何をさしているのかわからない。答えはスレ主しかわからないよね？（だから途中スルーしてました）。いやいや、自分の解釈以外ありえない！！と思うのでしたら、まぁそれはそれでどうぞ！ で、質問に答えます。 2700-12の後者の解釈は 「sepharoseに目的『外』のタンパク質が結合している」です。 私の解釈を（　）にいれて質問をコピペしました。 『protein G sepharose　とモノクローナル抗体を使用いているのですが、ネガコンとして抗体を使用せずにsepharoseのみで免沈したところ、通常の免疫沈降と同等のバンドが（目的タンパク質近傍に）検出されてしまいました。 おそらくprotein G sepharoseに非特異的に結合したものと思われるのですが・・・この非特異的なバンドを減少させる方法はありますか？』 上記の読み方もありですよね？ この解釈の根拠を書きます。 そもそもどんなタンパク質かわからないけれども、FLAGつけた目的タンパク質をFLAG-IPしたものとsepharose単体で落としたもので「同等」に目的タンパク質のバンドがでるかな？私はでないと思います（でるなら実験手技を疑います）。ですので（　）内の解釈で質問を理解し、preclearをすすめました。効果を疑うコメントもありましたが、効果があるケースも事実ですょね？ 実際のところ、『同等』がどの程度のバンドなのかもわからないんですよね。long exposureでやっとでるレベルなのか、1 secでばっちりでてしまうのかとかでいろいろ可能性やsuggestionが変わります。 私が仮にレフトさんのようにsepharoseに目的タンパク質が結合していると判断したなら、前に案がでていましたがFLAG elutionを勧めたと思います。でもマグネットビーズを勧めるのもいいと思いますょ！

(無題) 削除/引用 No.2700-33 - 2010/06/11 (金) 16:38:32 - UT どんどん本質から離れていきますが・・・ 非特異的（目的タンパク以外）なものという意味であれば、 抗体を入れて免疫沈降した時に、抗体を入れていない時に出てくるバンドが見える というようになると思います。 抗体を使用していない時を問題視されている以上、抗体非使用時に見られるはずのないバンド→目的タンパク質 というのが国語的な理解だと思います。

(無題) 削除/引用 No.2700-32 - 2010/06/11 (金) 16:31:16 - NF 横槍で申しわけありません。 研究の話から、文章の話に話題がそれているように思います。 純粋に研究の話をするために、一度、トピ主さんが書き込まれるのを待たれて、その後、再開してはいかがでしょうか？ 最近、トピを立てたのにそのままの方がおられるようですが、今回はそうならないことを願います。

(無題) 削除/引用 No.2700-31 - 2010/06/11 (金) 16:14:13 - IP-WB 私も最初、後者の意味で理解しました。 >>抗体を使用せずにsepharoseのみで免沈したところ、通常の免疫沈降と同等のバンドが検出されてしまいました。 の部分ですが、目的のタンパク質以外のバンドのことについて言っているようにも見えました。実際、プロテインAセファロースに抗体を加えていない場合でも、抗体を入れた時と同じ分子量付近に非特異バンドが出てきます。 だからプレクリアが非常に有効だというのは理解できます。 非特異的に結合しているのが、目的タンパク質か目的タンパク質で無いかは書いていないように見えます。

(無題) 削除/引用 No.2700-30 - 2010/06/11 (金) 14:57:30 - レフト 千夏さんがNo.2700-12で仰っている後者の解釈というのが何を指しているのか教えていただけませんか。 私に国語力が欠けているということなのでしょうが、前者の解釈以外にどのような読み方ができるのか私には分かりません。

(無題) 削除/引用 No.2700-29 - 2010/06/11 (金) 14:02:03 - UT 言葉の解釈の問題で前提が異なることに起因した意見の違いで なぜ互いを非難する必要があるのか。 どちらの立場の方も、当初は別の解釈について気付いておられなかったようですが、そういう解釈もあるのね、というだけのことでしょう。 ちなみに国語の問題に関しては、私はTSさんと同じ解釈です。 目的タンパク以外がセファロースにくっついてきちゃうよという内容なら、同等のバンドなどというややこしい表現は必要ないですから。 現実がどうかはわかりませんが、トピ主の思っていたところとしては目的タンパクがくっついてくるという方が自然ではあると思います。

(無題) 削除/引用 No.2700-28 - 2010/06/11 (金) 11:42:51 - 千夏 スレ主消失しちゃってるのでスルーしてたんですが、まさかpreclearしては？発言でここまでスレのびるとはｗｗ 前にも書いたし(2700-12)、名無しさん(2700-23)などもふれていますが、非常に難易度の高い国語の問題がからんでいるので、状況のコンセンサスを得ないと答えはでないし（そもそも手は複数あるわけだし）、そういう状況で「Pre-clearは、だめでしょう。」(2700-9)はいかがなものかと思うなぁｗ だって、状況を一番把握しているスレ主は、 「おそらくprotein G sepharoseに非特異的に結合したものと思われるのですが・・・」と考えているんだから、だったらpreclearしたら？っていうsuggestionはだめじゃないでしょう。だって目的のタンパク質がsepharoseに結合しているのかどうかは文面からは判断できないんですから。 また一般的に考えて市販のFLAG抗体(M2など）は非常に特異性が高いですし、スレ主の系は過剰発現系です（多分・・ｗ）。その場合、TSさんが言う目的タンパク質が仮にsepharoseに結合しているんだとしてもsepharose単独がsepharose+FLAG abと同等に目的タンパク質を落とし、WBで差が見分けられないとは考えにくくないですか？（仮にそうなら実験系の見直しが先決であり、マグネットビーズうんぬんの話ではなくなる） よってsepharoseに結合する目的外のタンパク質がFLAG abと反応していると想定し、だとすればpreclearをすればスレ主が望む「非特異的なバンドを減少」させる可能性はあります。 スレ主がWBでなく銀染色の話をしているんなら、なおさらpreclearは効果的である可能性があります。 マグネットビーズは便利ですが、特別な器具が必要になります。一票いれるのはいいですが、それはスレ主のラボに必要な器具を購入しろと言っていることになります。私にはその度胸はないｗｗｗｗ　私はむしろ実験系を見直したほうがいいんでないかい？と思っています。sepharose乾燥させちゃってない？とか！

(無題) 削除/引用 No.2700-27 - 2010/06/11 (金) 08:35:31 - NF 確かに、proteinGに結合しているのかそれともSepharoseに結合しているのかアグっているのか知りたいところです。 これらは、遠心操作に加え、Sepharose担体・Sepharose-proteinG・Sepharose-anti-mouseIgGを使い分ければ判断できるのではないでしょうか？ もし、Sepahroseに強く結合するのであれば、Sepahroseの担体を変えてみるといいかもしれません。 あるいは変法ですが、FLAG融合蛋白質発現の有り・無しのライゼートを用意して、両方をSepharoseのみでIP(?)させ、FLAG融合蛋白質有りの方で特異的にみられるバンドを探してみてはどうでしょう。何か情報が得られるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2700-26 - 2010/06/11 (金) 08:08:58 - レフト TSさんはどなたの書き込みも馬鹿してはいないと思いますが。 私もNo.2700-13に書いた理由でTSさんに一票。

Sさんへ 削除/引用 No.2700-25 - 2010/06/11 (金) 03:52:24 - モモ ご指名なのででてきましたが。 なぜ、根拠のない理由で他人の書き込みを馬鹿にしたTSさんが擁護されて、 それを明確な根拠で非難した私が問題にされるのか、私には到底理解できませんが。 最初に問題行動を起こしたのは紛れもなくTSさんなのですが。 その点はスルーですか？ STさんや、Sさんなど、TSさんと名前が似ている人たちは、みな同じように理解力がないのでしょうか（笑）。

(無題) 削除/引用 No.2700-24 - 2010/06/11 (金) 03:24:49 - S 名無しさんのおっしゃるとおりですね。 トピ主さんのおっしゃってる「同等のバンド」というのが、何か気になるところです。私は、WBで検出した、という意味合いで受け取りましたが、実際のところどうなのでしょう？ TSさんが尋ねているように、目的も気になるところです。 まぁ、モモさんは、ご自分の言動を省みた方が良いと思います。あまり良い印象を与えていませんよ。

(無題) 削除/引用 No.2700-23 - 2010/06/11 (金) 02:32:49 - 名無し 担体に大事なものが吸着してしまうようならば、私ならば担体の種類を変えて（というか何種類かの異なる担体で検討して）そうしたことが起こらないものを選ぶということで対処するとおもいます。またsepharoseまたはprotein Gにもし親和性があるということが確実であれば、それはそれで逆にそれを手がかりに面白い展開が出来るような予感がします。sepharose 担体でアフィニティ精製できるとか、Fcポーションと構造的に似た部分があるとか、細菌の表層との相互作用の可能性とか。 『同等のバンド』という表現がいまいち私らには分かりにくくて、たぶんそれがいろいろ揉めている原因の一つではないかと思うのですが、検出はウェスタンでしょうか。一応念のためですがそのバンドはprotein G 由来のものとは違うということは大丈夫ですね。protein G もビーズへの架橋は100%でないので、SDS電気泳動すると、ものにより程度の違いはあるもののいろんなシグナルが変な感じにラダーっぽく出てバックグラウンドがきたなくなります。normal IgGも使っていればそれ由来のものも出ます(今回はコントロールはビーズだけのようですが、ほんとうは等量のnormal IgG-protein G beadsでやらないとコントロールになりません）。これらは抗体のビーズの方もnormal IgGのコントロールのビーズの方も同じように見えてくる訳ですが、これらのバックグラウンドのシグナルを沈降物のシグナルと誤認しているということはないですね。サンプルなしでビーズだけのものも並べて流してみたことありますか。

(無題) 削除/引用 No.2700-22 - 2010/06/10 (木) 23:06:23 - ma そういう感情的になった言い合いみたいなのやめましょうよ、、、、。 せっかく良いサイトなのに。 その非特異的と思っているバンドがモノである可能性が高いなら、 やっぱりプレクリアは選択として問題があると思いますが。 そうでなくとも、これは経験的にですが、プレクリアで劇的に変わった印象はないかなあ、、。 既に議論にあるように、可溶性画分のみを使用しているかというのはチェックの価値アリかも。 あと通常の免疫沈降のサンプルではモノは落ちてるんですかねえ、、、、。

(無題) 削除/引用 No.2700-21 - 2010/06/10 (木) 23:02:48 - ami マグネットベースのビーズに１票。非特異的結合少ないですよ。

(無題) 削除/引用 No.2700-20 - 2010/06/10 (木) 22:30:54 - モモ TSさんが恥をさらし続けているみたいなので、ご忠告ですが。 千夏さんの書き込みはプレクリアーを勧めている（２７００−６）のであり、しかもTSさんのその後の書き込みには否定的（２７００−１２）な立場なのですが。 文章読めてないのは誰なんでしょうね。（笑） ＞Pre-clearで、かなり持ってかれちゃうし、続くIPでも同じようにくっついちゃうでしょう。 この理屈では、今回の場合だけでなく、すべてのIPにおいてプレクリアーを否定していることになります。要するに、あなたはプレクリアーの意味がわかっていなかったわけです。同じ蛋白であればすべての分子が同じ挙動をするはず、などと考えている時点で、IPや蛋白精製のことがわかってないなぁ、という感じです。 それから、IPの初心者と思われるヒトからの質問に対し、実験条件の検討もせず、他のビーズを勧めるというのも、指導者としての態度として疑問があります。 以上の点により、TSさんは文章もろくに読めてないし、実験のことも大してわかっていないことが明白なわけですから、安易に他人の書き込みを否定するような態度は以後慎むべきと私は思います。

(無題) 削除/引用 No.2700-19 - 2010/06/10 (木) 07:35:56 - プレクリアー そうか、、、くっついて困っているからダメか。 まあ、問題を切り分ければ簡単かもしれません。 プロテインGにくっついているのか？、セファロースにくっついているのか？簡単に分かりますよね。両方とも、もともと非特異的にくっつきにくいから使われているわけで、実験手技の問題もかなりありそうです。洗浄液の塩濃度、組成は大丈夫かとかいった、、、。 場合によってFLAG-Agaoseを使うというのもありですね。

(無題) 削除/引用 No.2700-18 - 2010/06/09 (水) 16:49:41 - UT 根本的な解決にはならないかもしれませんが ブロッキングを、タンパクを発現させていない細胞？のホモジネートでやるのはいかがでしょうか。 思いつきなので間違っていれば無視してください。

(無題) 削除/引用 No.2700-17 - 2010/06/09 (水) 16:44:03 - qq ＞思ったりしますが。マグネットタイプは、非特異的な吸着が少ない、と言うのが１つの売りですから。 非特異的な吸着と思っているものが、単に不溶化したタンパク質であることが多いので、マグネットタイプだと除去しやすい。と言う意味ですよね。

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