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(無題) 削除/引用 No.2700-16 - 2010/06/09 (水) 13:46:36 - ST TSさんに一票。

(無題) 削除/引用 No.2700-15 - 2010/06/09 (水) 12:35:53 - TS >自分の考えがすべて正しいとでも思っているんでしょうか・・・ のTSです（笑 そんなこと思ってませんけど（笑 でも、やはり状況から判断して、レフトさんや千夏さんがおっしゃるように、プレクリアの効果は薄いのでは、というのが私なりの判断です。 ちょっと流されていますけど、最初に提案させて頂いた、マグネットタイプ、あるいは、他の担体にProteinGが結合しているものを試す意義はあるのではないかなぁ、と思ったりしますが。マグネットタイプは、非特異的な吸着が少ない、と言うのが１つの売りですから。 あいぴーさんが提案されている、ブロッキングの条件（濃度、使用タンパク質）を検討するのも、すぐにできる対策ですね。 それと、そもそも実験目的は何なのでしょうか？ IPした後に何がしたいかによって、対策も多少は変わってくるかなと思います。 Co-IPで相互作用しているタンパク質を検出したいのか、MSにもっていきたいのかとか。MSにまわすのなら、ゲルで分離すれば、良いと言うことにもなりますよね。

(無題) 削除/引用 No.2700-14 - 2010/06/09 (水) 10:14:42 - MP IPの際のチューブに蛋白が吸着することもあるので、IP後の洗いを別のチューブでやると、ほんのちょっとはバックが下がるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2700-13 - 2010/06/09 (水) 09:21:23 - レフト この場合のプレクリアは、本来のプレクリアとしてはやっぱり意味が無いように思います。目的のタンパク質が減るだけですので。アグって沈殿云々は、それとは別に対処すべき問題だと思います。また、用いている抽出条件でアグるのがそのタンパク質の振る舞いなら、それを取り除いてしまって残った画分というのは何かが違っているマイナーフラクションで、本来の振る舞いとはかけ離れている危険性も考慮されるべきでしょう。

(無題) 削除/引用 No.2700-12 - 2010/06/09 (水) 09:18:23 - 千夏 「sepharoseのみで免沈したところ、通常の免疫沈降と同等のバンドが検出」 ＝セファロースと目的タンパク質がくっついてる or ≠セファロースと目的タンパク質がくっついてる 前者の解釈ならPreclearはダメですね！ 私は後者の解釈をしましたがｗ 国語の問題とするにはかなりの難問です・・・orz

(無題) 削除/引用 No.2700-11 - 2010/06/09 (水) 05:29:20 - あいぴー 標的タンパク質にもよりますが、通常の遠心で除核、除デブリの後に、さらに超遠心（100,000g 30min位？）することで細かなデブリスをかなり除けると思います。さらに前後してプレクリアすればサンプルとしてかなり綺麗な物が得られるのではないでしょうか？（ただ私の場合もプレクリアは常にしていますが、それでも非特異的な結合はかなり見られるのでその効果が絶対だとは思いません。もちろん意味がないとも思っていませんが。） しかし>>TSさんの御指摘通り、質問者様の場合、目的タンパク質そのものがセファロースに結合してしまっている、という問題ですよね。 でもこの場合もアグってビーズとともに落ちて来てしまっている分は減らせるのではないでしょうか？あとは液量がそれなりにあるのであればフィルターに掛けるとか。 ただネイティブ？な目的タンパク質がビーズにくっついてしまっているとすると、質問者様のblockingというのは多いに有りだと思っています（私は1% BSAで効果があった事はあります。）。 他のバッファー組成はどのような感じでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2700-10 - 2010/06/09 (水) 04:37:07 - モモ プレクリアーが意味がないと書いている人がいますが、根拠は何なんでしょうね・・・ 自分の考えがすべて正しいとでも思っているんでしょうか・・・ まあ、それはそれとして。 プレクリアーには比較的短時間でアグってくる蛋白を除くという意味があります。目的蛋白の一部がアグってきてそれがビーズと一緒に非特異的に落ちてくる場合には有効の可能性があります。 また、ノンスペを減らすための他の方法も、目的蛋白が非特異的にビーズにくっつくのを減らすための方法でもありますので、すべて有効になる可能性があります。 私が良く見かけるまずい方法としては、アグリ易い蛋白をO/NでIPするものです。この場合、ネガコンにも大量のアグッた目的蛋白が落ちてきて失敗となります。

(無題) 削除/引用 No.2700-9 - 2010/06/08 (火) 23:53:07 - ＴＳ この場合、Pre-clearは、だめでしょう。 セファロースと目的タンパク質がくっついてるんだから、 Pre-clearで、かなり持ってかれちゃうし、続くIPでも同じようにくっついちゃうでしょう。 なんか、ただのIPで非特異的なバンドを減らしたい、という質問だと思っている人が多いような気がしますけど。。。 もう少しちゃんと読んであげないと。。。

(無題) 削除/引用 No.2700-8 - 2010/06/08 (火) 21:58:34 - プレクリアー この場合、プレクリアーですよね〜。コントロールの抗体をさらにいれて、プレクリアーが正解かと？

(無題) 削除/引用 No.2700-7 - 2010/06/08 (火) 21:44:14 - 名無し 免疫沈降に使う試料は遠心等で、微細な不溶物を可能な限り除去しておくことが大切です。肉眼では見えるか見えないかのごく僅かなものでも蛋白質の持ち込みとしては厖大です。いったん持ち込んでしまうと免沈時の遠心操作でビーズとともに沈殿しますから、IP精製画分までついてきます。長いDNAなど粘性を生じる原因になるようなものは（超音波や酵素処理）除去しておくほうがいいです。DNaseは膵臓由来は使わないように注意。トリプシンのコンタミがあると良くないので。 試料蛋白質の可溶化に使ったbufferと同じ組成のbefferを最後のステップまで出来る限り通して使う。IP操作過程でbuffer組成が大きく変わると、それまで溶けていたものが溶けなくなってきたりするおそれがあります。 私もprecleaningは普段、一応やっていますが期待するほど効果があるように感じた事はないです。やらないときよりはちょっとはマシかなあのレベルです。 材料が培養細胞でLC-MS/MSが使えるラボならSILAC法が良いと思います。非特異的吸着などにるバックグラウンドがあっても正しく定量できます。

(無題) 削除/引用 No.2700-6 - 2010/06/08 (火) 18:46:52 - 千夏 lysateにprotein G sepharoseをいれて、4℃,1時間ぐらいまわしてprotein G sepharoseを除いたものをIPにもっていっては？　Preclearというヤツです。

(無題) 削除/引用 No.2700-5 - 2010/06/08 (火) 18:37:18 - モモ ＩＰでノンスペを減らす方法として、 １）ビーズの使用量を減らす ２）ＷＡＳＨをより厳しくする ３）ビーズとのインキュベーションの時間を短くする などが考えられます。 前回のプロトコールで一番まずそうなところをひとつ変えて試してみてはいかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2700-4 - 2010/06/08 (火) 16:01:45 - masa FLAGペプチドで溶出させたり、washバッファーの塩濃度やデタージェントの濃度を検討したりするのが一般的かと思いますがどうでしょうか？ 後は私の経験でDNaseで処理するとバックが減少したことがあります。DNAがビーズに吸着してそれに目的のタンパク質が結合していたのだと考えています。

(無題) 削除/引用 No.2700-3 - 2010/06/08 (火) 15:46:14 - TS 非特異的なバンドではなくて、目的タンパク質が、セファロースにくっついてしまっている、と言うことですよね。Co-IPとかでは、困りますよね。 マグネットタイプのビーズにすると、非特異的な結合はそれなりに減ることも多いと思います。このあたりは、試してみないとわかりませんね。タンパク質によると思いますから。

(無題) 削除/引用 No.2700-2 - 2010/06/08 (火) 15:25:12 - うーん 免疫沈降後にMSにでもかけるのでしょうか？ そうでなければ、非特異的bandが目的のFlag融合タンパクのMWと重ならない程度であればさほど問題にはなりませんが、、

免疫沈降　非特異的結合 削除/引用 No.2700-1 - 2010/06/08 (火) 15:18:07 - きゃず 現在、研究室でFLAG融合タンパク質の免疫沈降を行っています。 protein G sepharose　とモノクローナル抗体を使用いているのですが、ネガコンとして抗体を使用せずにsepharoseのみで免沈したところ、通常の免疫沈降と同等のバンドが検出されてしまいました。 おそらくprotein G sepharoseに非特異的に結合したものと思われるのですが・・・ この非特異的なバンドを減少させる方法はありますか？ すでに、protein G sepharoseを0.1％ BSAで処理するという方法は試してみたのですが、効果は見られますんでした。

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