全10件 ( 1 〜 10 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.2717-10 - 2010/06/12 (土) 15:57:11 - cell >>ats様 ありがとうございます。 stop-リボソーム結合部位-ATGの配列なのですが、 stopとリボソームの間、リボソームとATGの間には１０塩基ほどアミノ酸を挟むつもりでしたが、書き忘れてしまいました。近くにあると怖いので。 皆様のご意見を参考にしたいと思います。 今回は、ペプチドのN末に６残基ほどあっても問題ないと考え、とりあえずプラスミドを作製したいと思います。 ＜他のシグナル配列＞-リンカー-＜細胞膜透過性ペプチド＞-リンカー-タンパク質 というプラスミドもいくつか論文で見かけたので、６残基ほどなら問題ないかな？と考えました。

ベクターを変えたら 削除/引用 No.2717-9 - 2010/06/12 (土) 13:43:46 - ats APさんの意見に賛成です。 stop-リボソーム結合部位-ATGあたりの配列によって翻訳効率が大きく変わる可能性があります。 大腸菌のオペロンを眺めると、リボソーム結合部位は直前のORF内もしくはstopコドンに重なっていることが多いです。前のORFを合成したリボソームがRNAから離れることなく次のOFRの翻訳を始めるためだと思っています。 そこでpETシリーズやpColdシリーズ（だったかな？）を参考にするとよいでしょう。”Translational Enhancer”というkeywordで探してみてください。 というか、これら専用？の発現ベクターにペプチド-蛍光タンパク質を入れる方が大量に産生されると思います。 pAcGFP1はpUC oriの多コピーplasmidかつlac promoterを利用しているので、非誘導時でも目的タンパクが発現していると思います。このため、ペプチド-蛍光タンパク質が大腸菌の生育に不都合だとplasmidが不安定になるかもしれません。 また、使用コドンは大腸菌のメジャーコドンを使いましょう。 精製を考えているなら、蛍光タンパク質のC末または、peptide（+多少のリンカー）と蛍光タンパク質の間などにHisタグ等を入れておくとよいかも（ただしpeptideの機能に影響がある可能性もある）。

(無題) 削除/引用 No.2717-8 - 2010/06/12 (土) 12:02:18 - cell >アイピー様 ご丁寧にありがとうございます。 はい、発現系は大腸菌です。 アイピー様のおっしゃる方法も勉強し検討してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2717-7 - 2010/06/12 (土) 11:57:12 - アイピー 連続ですいません。 欠損（欠損）は欠損（欠失）の間違いです。 失礼しました。

(無題) 削除/引用 No.2717-6 - 2010/06/12 (土) 11:53:04 - アイピー 無責任に一先ず一つ貼付けます。 http://www.toyobo.co.jp/cgi-bin/blog/applications/files/seihin/cloning/SMK/20061214manual_06-12.pdf 他にも挿入、欠損（欠損）、変異、DNA、プラスミドなどをキーワードにすると色々引っ掛かります。 発現系はつまり大腸菌ですよね？？そうすると哺乳類の発現系を主に使っている私には、質問者様のアイデアがどうなのか？については分かりかねます。少なくとも先程提示した方法自体はマンマル、大腸菌用の、コンストラクトの構築、発現までいけるはずです。しかしポリメラーゼ、プライマー等余計な材料を必要とします。

(無題) 削除/引用 No.2717-5 - 2010/06/12 (土) 11:50:56 - cell lacZの開始コドンの前の配列は以下のようになっており、GGAがリボソーム結合部位となっております。 AGGAAAACAGCT さらに、リボソーム結合部位の−20ほどにBsrBIという制限酵素部位があります。

(無題) 削除/引用 No.2717-4 - 2010/06/12 (土) 11:24:25 - cell >AP様、アイピー様 迅速な御回答ありがとうございます。 使用しようと考えていますプラスミドは、pAcGFP1です。www.clontech.com/images/pt/PT3715-5.pdf 使用する制限酵素は、Hind�VとKpn�Tです。 すみません、初心者なものでアイピー様の方法がイメージできません・・・

(無題) 削除/引用 No.2717-3 - 2010/06/12 (土) 11:03:27 - アイピー APさんに同意です。 専門が大腸菌ではないのでコメントが的外れかも知れませんが、私ならインサートしたい領域+内在の領域のプライマーを発注してPCR掛けるか、一回制限酵素で切って、入れて、その後不要な領域を削るか、という手順を踏みます。 不明な点はまた御質問下さい。どなたかが（私を含めて）きっと答えてくれます。

(無題) 削除/引用 No.2717-2 - 2010/06/12 (土) 09:20:09 - AP 大腸菌の転写産物はもともと多シストロン性だったりするので、デザインされたような複数のRBSが機能することは期待できますが、ほかの選択肢も含め、やって見なければわからないというのが正直なところではないでしょうか。 ところで、どういう制限酵素末端でligationしようとしていてMCSはどういう構成なのでしょうか。その6残基を飛ばしてligationする工夫があるかもしれませんので。あるいは20残基くらいのペプチドなら、良い位置にligationできる付着末端を含めて、合成オリゴDNAでinsertを作るとか。

こんな設計ってありですか。プラスミド。 削除/引用 No.2717-1 - 2010/06/12 (土) 02:39:21 - cell ある蛍光タンパク質発現プラスミドのN末端のMCS（マルチクローニングサイト）の２０残基ほどの生理活性のあるペプチド配列を導入しようと考えているのですが、制限酵素で切ってそのペプチド配列をそのまま入れると大腸菌で発現させた際に、ペプチド配列のN末端に６残基ほどの余計な塩基が付いてしまいます。そこで、その６残基の塩基を無くし、ペプチド配列から読ませるために、以下のように変更を加えたいと考えているのですが、うまくワークするでしょうか。始めてプラスミドベクターを作るものですがから、ちょっと不安です。 リボソーム結合部位-ATG-MCS-蛍光タンパク質-stop ↓　そのままMCSにペプチド配列を組み込むと リボソーム結合部位-ATG-(6残基)-ペプチド-蛍光タンパク質-stop ↓　そこで リボソーム結合部位-ATG-(6残基)-stop-リボソーム結合部位-ATG-ペプチド-蛍光タンパク質-stop つまり、MCSにstop-リボソーム結合部位-ATG-ペプチド-を組み込むことにより、もともと組み込まれているリボソーム結合部位からの読み込みをペプチドの前で止めてしまい、そこに新しいリボソーム結合部位、ATGを組み込むことで、ペプチドから翻訳されるようにしたいと考えております。 ペプチドのN末に６残基ほど付いてもペプチドの活性が保たれてればいいんですけど、不安です。 このペプチドは細胞透過性ペプチドであるので。

全10件 ( 1 〜 10 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---