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(無題) 削除/引用 No.2765-4 - 2010/06/25 (金) 21:23:05 - じゅん 通りすがりさん、Eireさん レスが遅くなりすみませんでした。 お二人ともスライドグラスに貼り付けを行っているのですね。 大変参考になる文面でした。 早速トライしてみようと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2765-3 - 2010/06/23 (水) 20:46:42 - Eire >じゅんさん 私も通りすがりさん同様、反応はマルチウェルプレートを使っています。私の場合は複数の切片を 6-well plate で一度に処理しています。 さて、本題ですが、私の場合は次のように処理しています。 (1) 発色（色素、蛍光）、洗いの後、4% PFA/PBS で後固定します。 蛍光色素がこの固定で弱まることは今までありません。 (2) 固定後 PBS を入れたディッシュに切片を移し、絵筆で切片を拾い、スライドグラス上に移します。絵筆は水彩用の平筆が使いやすいです。切片の大きさに合わせて各種用意しておくと便利です。筆はあらかじめバッファーで十分湿らせて下さい。でないと切片が絵筆に張り付いて取れなくなってしまうのと、切片のスライドグラスの間に気泡が入り、それを除くのが面倒です。スライドグラスは、私は SuperFrost Plus を使っています。コートしたものを使わないと切片が張り付かないと思いますが、張り付きが良すぎると、切片を平らにする前にスライドグラス上に張り付いてしまいます。 また、(1) で述べた固定をしておくと、切片がほどよく堅くなり、この後の作業が行いやすい印象があります。 (3) スライドグラス上に移した切片を、絵筆を使って平らにし位置を整えます。まず湿らせた絵筆で大体の位置を整え、次に乾いた絵筆（全く乾いたものよりも、一度湿らせてからペーパータオルなどで水分を除いたものの方が使いやすいです）で、切片の周りの水分を除きながら、切片を平らにしスライドグラスに密着させます。この辺りは水分を除くスピードを調節しながらやると良いです。はじめはあまり重要でない切片を使って練習するといいと思います。 また、切片の移動には大きめの絵筆、水分を除くには小さな絵筆を使うとやりやすいです。水分を除く絵筆は適宜ペーパータオルなどで水分を除きながら使ってください。 (4) 切片を貼り付け終えたら、スライドグラスを平らな場所に静置し、一晩乾燥させます。通りすがりさんのように短時間でも十分ですが、私は大体一晩おいています。蛍光の場合は暗所において下さい。これで切片が完全にスライドグラスに張り付きます。この作業で蛍光シグナルや発色シグナルが落ちるという経験はありません。 (5) あとは通常の切片と同様に扱って大丈夫です。私は PBS を入れたスライドメーラーにスライドグラスを移し十分洗った後、蒸留水で軽くリンスし封入しています。蛍光の場合は水性系（褪色防止剤入り）、DAB 発色の場合は脱水、透徹後キシレン系の封入剤を使っています。 以上です。なお、私は上記作業を実体顕微鏡下で行っています。蛍光発色の場合褪色が心配でしたが、 Cy2, Cy3, Alexa488 等の蛍光色素では、作業中に激しい褪色が起きることは経験していません。もちろん、作業を素早く行う方が良いのは言うまでもありませんが。 それでは、お役に立てば幸いです。

(無題) 削除/引用 No.2765-2 - 2010/06/23 (水) 18:43:36 - 通りすがり >脳凍結切片を50umで作成後、エッペンチューブに移し、 　私はエッペンは使いません。日本にいたときは小さなガラスのバイアル（底面の直径が１ｃｍくらいの）、アメリカでは２４穴プレートを使っています。エッペンだと切片が折りたたまってしまい、むらができるような気がして。 　ところで、凍結切片で５０umいけるのはなかなかすごい技術ですね。関係ない部分で感心してしまいました。 　さて、最後のステップですが、この記述だけではわからない部分があります。つまり、DABなどの明視野か蛍光の暗視野かで大きく違うと思います。前者は脱水系列が必要ですから。 　たぶん、蛍光ではないかと思うので、それを前提で話を進めます。まず、スライドガラス（コート済み)の上に表面張力を利用してなるべく多くのPBSを載せます。小さな絵筆やつまようじなどを用いて切片をそこに移動し、平らにします。ピペットやろ紙、キムワイプなどを用いて、余分な液を除去します。このとき、切片が動かないように気をつけてください。液が見た目上消えたら、暗所に放置（３０分くらい？)し、完全に乾燥させます。乾燥しても蛍光は消えないようです。 　その後、切片上に封入剤を滴下、そしてカバーグラスをのせます。５０umなら、切片がつぶれるということはありません。 　人によっては、PBSの代わりに水をつかうこともあります。PBSだと乾燥後に塩が析出してしまうからです。封入剤で塩の結晶が消えない場合、水のほうが良いかもしれませんが、水の中だと切片がべたべたしてしまい、扱いがかなり厄介になります。

Free-floating IHC 削除/引用 No.2765-1 - 2010/06/23 (水) 17:17:11 - じゅん いつも参考にさせて頂いてます。 Free-floating IHCのことで、どなたかのアドバイスがあればと思い投稿しました。（近くのラボではFree-floating IHCは動いてなく、参考に出来ませんでした。） 脳凍結切片を50umで作成後、エッペンチューブに移し、 エッペンチューブ内（ローテーターで優しく回転しながら)で、ブロッキング、洗浄、抗体反応を行っています。ここまでのステップは論文等を参考にして行いました。 しかし、最後のステップの観察なのですが、どのようにして行ったらよいか見当も付きません。実際には、「この切片をスライドにどのように貼り付ければよいか？」、「カバーグラスを被せると切片がつぶれてしまうのではないか？」などです。 どなたかご存知の方がいらっしゃいましたら、アドバイス等よろしくお願いします。

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