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(無題) 削除/引用 No.2844-7 - 2010/07/08 (木) 10:09:27 - 夏 ありがとうございます。 クライオスタットではうまく切れていると思ったのですが、染色したときに顕微鏡でみると空砲が多くみえるのです。脳は、4℃で4%PFAで1晩浸漬固定して、その後15%スクロースで1晩、30%スクロースで1晩浸漬固定してから凍結ブロックを作っています。脳はきちんと沈んでいるのを確認しています。 今まではきれいな切片ができていたのですが。。。 お二方にご指摘いただいたように、固定がうまくいっていないのかもしれません。クライオスタットを使用するときの温度も気をつけてみます。あとは1晩たたないうちに染色してみます。 ご教授いただきありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.2844-6 - 2010/07/08 (木) 06:23:26 - Eire マウスの age にもよるでしょうが、きちんと固定されていれば 20um でも薄すぎるということはないと思います。PBS (+azide; 私も組織さんと同じく、azide は関係ないと思いますが) に入れてすぐにボロボロになる、というのであれば、固定が不十分なのかな、という気が私もします。免役染色に使うもので抗原が固定に非常に弱いものでない、あるいは in situ ハイブリダイゼーションに使うのであれば、切片を PBS の代わりに固定液に回収して後固定すると、改善されるかもしれません。 クライオスタットの庫内温度が低すぎる可能性も考えられます。脳であれば -15~-20degC が適温だと思います。サンプルブロックをクライオスタットの庫内温度に十分なじませて、切片を切るときシャリシャリした感じでなく、少ししっとりした感触があれば良い感じです。 切片の保存については、組織さんも仰るように、PBS での保存は、一晩程度なら大丈夫でしょうが、長期保存には（azide を入れたとしても）向かないと思います。どうしても長期保存が必要であれば、cryoprotection solution (私が使っているのは 50% (v/v) 0.1M phosphate buffer pH7.4, 30% (v/v) ethylene glycol, 30% (w/v) sucrose です）に切片を移して十分なじませた後、-20degC 保存すれば可能です。

(無題) 削除/引用 No.2844-5 - 2010/07/07 (水) 21:07:23 - 夏 固定はそのようにしていますが、20μmでしていました。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.2844-4 - 2010/07/07 (水) 19:17:27 - 組織 後は固定時間が短いとか、切片が薄すぎるとかでしょうか。脳の既固定凍結切片なら、灌流固定後、4%PFAで4℃1晩浸漬固定、切片の厚さは30 umくらいが扱いやすいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2844-3 - 2010/07/07 (水) 18:56:51 - 夏 組織様、ご教授いただきありがとうございます。 4%PFAで固定したものを使用しています。

(無題) 削除/引用 No.2844-2 - 2010/07/07 (水) 17:56:23 - 組織 アザイドの濃度は関係ないと思いますよ。どのくらいの期間保存されるのかわかりませんが、アザイドを入れる必要はないと思いますし、アザイドが必要なくらい長期保存するのはあまりお勧めしません。染色結果の解釈を複雑にし得るファクターを入れるよりも、再度薄切した方が無難だと思います。 ちなみに確認ですが、固定はされてますよね？もし新鮮凍結切片なら、固定してから保存しないと、ぼろぼろになると思います。

浮遊切片の保存方法 削除/引用 No.2844-1 - 2010/07/07 (水) 15:19:11 - 夏 マウス脳の凍結切片をPBSに浮遊させて4℃保存しています。 保存するときにPBSにアジ化ナトリウムを入れていますが、濃度で悩んでいます。（調べてみたのですが、このことにふれている文を探せませんでした。） 0.01%でしたところ濃度のせいか分りませんが、組織がボロボロになってしまいました。0.1%にした方がいいのかなと考えています。 みなさんは、どのようにして保存されていますか？ 保存するときに、アジ化ナトリウムの濃度はあまり関係ないのでしょうか？

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