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(無題) 削除/引用 No.2928-5 - 2010/07/31 (土) 22:16:00 - Y2H 今日、mate後のplateを確認しましたところ、大量のコロニーを見てびっくりしました。 すばらしいです。 効率でいうと、今までの1X10^3 倍になりました。mate率はまだ出していませんが、相当な高率になりそうです。 mate前の水処理とplateでのmateのどちらが効果的だったのかはわかりませんが、ともかくこの２点が重要なのですね。 ただ、あまりの効率の良さに、1plateあたりに生えてくるpositive clone数が多すぎて、SD/-TrpLeu+AbA 上のコロニーが小さいのです。もしくは、小さすぎるのでpseudo positiveなのかもしれません。 やはり、ここでもトラブル２にあるような状況になってしまいました。 以前mateではなく、普通にbaitを保持したAH109にライブラリーplasmidを導入する方法でY2Hをやっていたときは、SD/-TrpLeu上でのクローンが1x10^5/plateでも十分コロニーが単離できました。また、この効率で選択培地1plateから生えてくるコロニー数を１〜５個平均になるようにしていました。 しかし、今回のplateではSD/-TrpLeuにて1x10^5/plateくらいですが、選択培地であるSD/-TrpLeu+AbAでは無数にコロニーが生えてきてしまいます。 細胞は薄めにまくべきでしょうか、それとも、現在選択開始から４日目ですが、もっと待った方がいいのでしょうか。さらに発想を変えて、もっときつい選択培地でスクリーニングした方がいいのでしょうか クロンテックではSD/-TrpLeu+AbAでの1stスクリーニングを推奨していますが、クロンテックの説明書に疑問がある今、この条件も信じられなくなっています。 ひとまず、また選択培地を変える方法や細胞数の検討をtryしてみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.2928-4 - 2010/07/24 (土) 18:31:17 - 通りがかり > liqでmateさせない利点がいまいちわからないのですが 実際に比較してみれば違いは一目瞭然です。 理屈は色々つけられますが、本当のところは分かりません。 単に３次元より２次元の方が出会う確率が高いというだけの事かもしれません。 > このratioは重要でしょうか 私は1:10以外でやったことはありません。論文によればその比が重要だそうです。 > ひとまず、手を動かしてみようと思います。 それがいいと思います。

ありがとうございます。 削除/引用 No.2928-3 - 2010/07/24 (土) 17:17:16 - Y2H 通りがかり様　大変参考になる文献をご紹介頂き、ありがとうございます。 確かにstep85以降の状況が参考になりそうです。 H2Oに2h放置は論文の中でも説得力があったのですが、liqでmateさせない利点がいまいちわからないのですが、なにか理由があるのでしょうか 私は baitにY2HGOLD, libraryにはY187を使用しています。 論文ではLibraryとbaitは1:10がいいとありますが、クロンテックでは1:1にするように書いてあります。このratioは重要でしょうか この２つの点についてまだ疑問なのですが、ご存知でしたらどうぞよろしくお願い致します。 ひとまず、手を動かしてみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.2928-2 - 2010/07/23 (金) 20:10:31 - 通りがかり 私も Clontech の AH109(bait) - Y187(Library) の系を利用してますが、mating は Nature protocols v1 p1066-91 (2006) を元にしたプロトコールを使っています。Clontech のプロトコールはうちでも全然ダメでした。 具体的なプロトコールは、論文のステップ85以降あたりを見てもらえばいいですが、 ・mating 前にイーストを dH2O に懸濁して2時間放置 ・液体培養でなくプレート上で培養して mate させる という点が大きく違います。 このプロトコールを使ってコンスタントに50％以上の mating 効率が達成できています。 ご参考まで。

Mate & plate yeast two hybrid screening 削除/引用 No.2928-1 - 2010/07/23 (金) 18:44:37 - Y2H クロンテックのmate & plate Y2H screeningで、あるタンパク質に対する相互作用因子を探索しています。しかし、どうしても改善出来ない点があるので、ご存知の方がいらっしゃいましたら是非アドバイスをお願いできませんでしょうか。 トラブル１＞mateの効率が悪い クロンテックの説明書通り、1x10^8/ml以上の濃度でmateさせています。mateの時間は36-40hです。yeastはフレッシュなものを使用し、library側は凍結から起こしてliq SD/-Leuにて数時間元気にしたものを使用しています。以前説明書通りに凍結から起こしてすぐにmateさせましたところ、全くmateしませんでしたので、クロンテックに問い合わせて、この方法を採用しました。しかし、mateの効率が0.1%とかそれ以下ですので、是非改善点などご存知でしたらお願い致します。 トラブル２＞SD/-TrpLeu+AbA plateにてコロニーが生えてこなくなった これは、もしかしたら、と思い当たるふしがあります。２週間前くらいからぱったりコロニーが生えてこなくなってしまったのですが、このころから非常に濃い細胞数を一枚のplateにまくようにしました。偽陽性の1mm以下のコロニーが無数に生えてきますが、以前のように2mm以上の大きさのものは全く生えてきません。高濃度でplateしたせいでしょうか？ あまり普及していない方法かもしれません。budding yeastをtoolに実験されている方でmate経験のある方や、実際に使用されている方など、是非お願い致します。

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