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(無題) 削除/引用 No.2971-11 - 2010/08/03 (火) 14:05:37 - 中年 マウスIgGで沈殿が見られないとのことで、単なるアグりではなさそうですね。FLAG依存的に抗FLAGビーズ表面に濃縮されることでアグリゲーションやビーズ担体への非特異的吸着が促進されるということかもしれません。いずれにせよ、モノクローナル抗体とそのエピトープとの親和性が融合パートナーによって極端に上がってしまうということは私には考えにくいです。 masa様、 結合が落ちる場合については承知していますし、頻繁に自分でも経験しています。誤解を呼ぶような書き方をしてすみませんでした。

(無題) 削除/引用 No.2971-10 - 2010/08/03 (火) 13:20:46 - Peptide セファロースとノーマルマウスIgGの組み合わせだとほとんどFLAG融合蛋白質の結合が見られない（WBでバンドが見られない）ので、とりあえずは、抗FLAG抗体と蛋白質が結合していると考えております。また、このことから、現在使用している免疫沈降のバッファーではアグっていないと思います。 ただ、溶出バッファー中でアグッている場合や、多量体を形成しているかどうかはわからないので、検討してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.2971-9 - 2010/08/03 (火) 11:47:03 - 異伝子 masaさん 今は結合はするが、解離ができていないのが問題だと思います。 そういうことは多々ありますが、結合はしているみたいなので。 で、中年さんが言っているようにそもそも結合していないのではということはあるかと思います（上記に反しますが）。で、中年さんの通りなのですが、具体的には まず、そもそも目的タンパクがアグっていないか確認。bufferによってアグらないか確認。それらがクリアされれば目的タンパクが抗体と結合しているのではなくビーズに結合していることを確認すればいいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.2971-8 - 2010/08/03 (火) 11:29:22 - masa 中年様 Peptide様の質問からは外れてしまうのですが、エピトープが目的タンパク質に埋もれてしまう？ような状態になると認識効率が落ちる事もあると思います。 私の経験でしかないのですが、ＷＢでは発現が確認できるのにIP効率が異常に悪いという組み合わせに遭遇した事があります。 その際はエピトープと目的タンパク質にスペーサーとなる配列を挿入することで改善しました。（発現量そのものには変化ありませんでした）なので融合させるタンパク質の性質によってはエピトープへの認識効率が変化することは起こりうることだと思っています。

(無題) 削除/引用 No.2971-7 - 2010/08/03 (火) 11:02:51 - 中年 モノクローナル抗体とそのエピトープとの結合の親和性が融合するタンパク質によって変化するというのもおかしな話のように思います。私にも同様な経験がありましたが、その時にはFLAG融合タンパク質がアグって遠心でビーズ側に来てしまっている（あるいはビーズ上でアグっている）か、融合タンパク質が多量体を作ってしまってビーズと多価で結合してしまっているのかなと思っていました。これが正しいなら、アグったり多量体になったりしにくいバッファー条件を探すことが解決になるのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2971-6 - 2010/08/03 (火) 08:29:11 - Peptide masa様 アドバイスありがとうございます。 IPバッファーおよび３７度での溶出、参考になります。これらは一度も試したことが無いので、次回ぜひ試してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2971-5 - 2010/08/02 (月) 22:30:14 - masa 溶出するときのバッファーを免疫沈降する際のバッファーで行ってみてはいかがでしょうか？考えにくいかもしれませんが、バッファーの組成が変わったことでアグリゲーションを起こしていたりはしないでしょうか？ あとは溶出する際の温度を37℃で行ってみるといいかと思います。転倒混和も激しくやるとビーズが飛び散ってしまい、溶出バッファーに触れていないものが出て来やすくなるので、静置で時々タッピングする程度に抑えてみてはいかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2971-4 - 2010/08/02 (月) 21:59:36 - Peptide アドバイスありがとうございます。確かにポジコンは必要ですね。試薬等のミスを除くためにも、ポジコンを作りたいと思います。 酸での溶出ですが、抗FLAG抗体とproteinGセファロースの組み合わせなので、抗体がproteinGから外れるのを嫌って、試しておりません。

(無題) 削除/引用 No.2971-3 - 2010/08/02 (月) 20:37:12 - His 酸による溶出は変性する可能性があるのでＥＤＴＡによる溶出はどうでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2971-2 - 2010/08/02 (月) 19:50:20 - in situ そんなにしょっちゅうあることではないと思いますが、溶出されにくいことはあります。 その時は3xFLAGペプチドを用いたり、酸による溶出をしたり（用途にもよりますが）していました。 ただ、スレ主さんの場合、一度も成功していないというのがちょっと気になります。 FLAGペプチドが分解してたり、もしくはFLAGペプチドの濃度を間違えていたりという可能性も否定できないと思います。 とりあえず、ポジコンとして、GFPのN末端にFLAGタグをつけたもの（C末端でもよいかも）でも使ってみることをお勧めします。 少なくとも自分のときはそれで溶出されていますし、GFPの場合色があるので溶出され具合が視覚的にも分かりやすいです。

FLAGペプチドによる溶出 削除/引用 No.2971-1 - 2010/08/02 (月) 19:29:05 - Peptide 現在、HEKで過剰発現させたFLAG融合蛋白質を抗FLAG抗体（M2）で免疫沈降し、FLAGペプチドで溶出しています。 FLAGペプチド（0.5mg/ml in TBS)を100ul加え、4度で30分転倒させ、上清を取るという操作を３回繰り返していますが、全く溶出されません。ちなみに、WBで免疫沈降が出来ていることは確認しています。 FLAGペプチドによる溶出は今回で2回目なのですが、前回別の蛋白質で行ったときも全く溶出されませんでした。 そこで皆様にお伺いしたいのですが、FLAGペプチドで全く溶出されないということは多々あることなのでしょうか？また、ペプチドの濃度や溶出回数を増やす以外で溶出効率を増やす方法はありますでしょうか？ FLAGペプチド溶出に関して、アドバイス頂ければ幸いです。

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