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(無題) 削除/引用 No.2976-4 - 2010/08/04 (水) 18:33:35 - protein ご質問の実験は、初心者の方が取り組む実験としては、すこし難しい実験とおもいいました。蛋白質の実験は経験的に得たものが大きいのでできればはじめはこの種の実験に経験ある方と一緒にやった方がいいのですが。 質問の中の『抽出』という部分に関してもう少し詳しい正確な情報いただけると助かります。何からちゅうしゅつするのでししょうか。ゲルですか。それともクルードな試料からビオチン化蛋白質を精製してというつもりで抽出という表現を使ったのでしょうか。 ここはより適切な回答を得るために重要な部分とおもいます。 塩酸グアニジンは蛋白質を溶かす働きをする変性剤ですから、その中で蛋白質を沈殿させるのは当然ながらとても難しいです。 塩酸グアニジンは透析で容易に除けると思います。ただ濃度がとても高いので外液は十分な量用意してかつ交換も普通よりも多めにしたほうがいいでしょう。２〜３時間ごとに数回変えてからあとはオーバーナイトとか。総外液量は大体どのくらい必要かは計算すれば分かると思います。低温でする必要はないと思います。pHは外液を換えていくうちにやがて外液のpHになるでしょう。蛋白質が不溶化する場合もありますのでその場合は透析後透析袋から上手に回収して下さい。まだ可溶化状態の蛋白質については、透析後、実験の目的や必要に応じて適切な方法で蛋白質を沈殿させて濃縮すればよいでしょう。古典的な方法としてはTCA(最終濃度10%)で沈殿させてその後アセトンで２回くらい遠心／洗浄して除酸、とかありますが成書を参照下さい。最後にSDS　sample bufferにとかしてみてもしまだ酸性なら濃いTrisちょっといれて青くなるまで中和して下さい。 グアニジン塩酸塩はSDSとまざると難溶性の沈殿を生じるので、SDS-PAGEで問題を生じさせます。その点でもグアニジンの除去は大事です。

(無題) 削除/引用 No.2976-3 - 2010/08/04 (水) 17:27:09 - AP 説明があまりお上手ではないでようで、、 要は、ビオチン化したタンパク質をNeutravidinのカラムで捕捉したのち、酸性条件の塩酸グアニジンで溶出したということですね。 溶出後ただちに中和するのは、酸性＋塩酸グアニジンで変性することでアビジンから引きはがすので、タンパク質自体へのダメージを極力抑えるためで、アセトン沈殿その他がうまくいかないというのとは関係無しです。 グアニジン塩酸はアセトンに溶けるのだろうか？　やったことはないけれどたぶん溶けないのでは（フェノールやクロロフォルムに溶けないのは経験済み。そもそもアセトンは塩を溶かしにくいので脱塩には不向き）。 なので、アセトン沈殿をしようとしても、水層がある程度脱水して高濃度の塩がさらに濃縮した段階で二層に分かれたままになってしまうのではないでしょうか。要するに、いきなりアセトン沈殿はむりじゃないでしょうか。常識的にまず透析などでグアニジン塩をのぞく必要があるんじゃないでしょうか。もし、アセトン沈殿などで濃縮する必要があるなら、そのあとです。 Neutravidinを使っているなら説明書にも、そう書いてないですか？

(無題) 削除/引用 No.2976-2 - 2010/08/03 (火) 23:49:56 - qq グアニジン塩酸は、それだけで酸性にはなりません。実際に、pH試験紙で確認してください。pHメータを使ってはいけません。 ＞抽出後タンパク質が８Mのｸﾞｱﾆｼﾞﾝ塩酸内に含まれています。１M,pH9のTrisを使って中和するようにとは書いてありますが、 とあなたは、書いてありますが、おそらくタンパクをグアニジンで変性させて、ビオチン化し、残存するビオチン化試薬をTrisでブロッキングしているのでしょうか？ NHS-biotinであれば（？）、50mM程度のTrisで十分な気もしますが、pH９を維持できる濃度が必要でしょう。 もう少し、詳しく書くとコメントがあるかもしれませんね。 質問文の中の「抽出」と言う言葉が、適切でないような気がします。精製、溶出、調製かそれ以外の言葉の方が、抽出よりしっくりくるように思えます。 何よりも、あなたのSV（superviserのことなの？）に丁寧に徹底的に聞くことです。

グアニジン塩酸内のタンパク質を分離する方法 削除/引用 No.2976-1 - 2010/08/03 (火) 05:49:08 - みど こんにちは。タンパク質初心者です。とても初歩的な事で躓いているのかもしれませんがご教示戴けると幸いです。 タンパク質抽出の際に目的のタンパク質をビオチン化して ウェスタンでバンドを特定後に質量分析をする予定です。 が、SVにゲルを見せた所バンドとスメアが多すぎるのでビオチン化タンパク質を抽出してから泳動するように言われました。 現在NeutravidinとGravity Flowカラムを使ってビオチン化タンパクを抽出しようとしているのですが、抽出後タンパク質が８Mのｸﾞｱﾆｼﾞﾝ塩酸内に含まれています。１M,pH9のTrisを使って中和するようにとは書いてありますが、どの程度入れたら良いのかもわからず・・・。 あまりにもpHが低いサンプルはゲルに流してもデータが取れないと思い、 （そもそも希釈され過ぎていてきちんとしたバンドが出るだけの量が流せないかと…）グアニジン塩酸を取り除こうと、アセトンでタンパク質沈殿を試みてみました。が、塩酸とアセトンが分離したままで上手くいきません。サンプルの４倍ほどの1MTrisで中和してからも試してみましたが分離してしまいました。（アセトンは透明のまま、遠心分離も物は試しと回してみましたが何も出ず） どうしたら良いものやら途方に暮れています。どうかご教示ください。

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