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(無題) 削除/引用 No.3-10 - 2010/08/05 (木) 16:06:00 - HS すみません。 細胞はロットを変えて試していたのですね。 見落としていました。 できれば、削除お願いします。

(無題) 削除/引用 No.3-9 - 2010/08/05 (木) 15:33:44 - HS 今更ですが。 かなり前のことになるのでもうHep太郎 さんにはお役に立てないかもしれませんが少々気になる点があったので、書き込ませていただこました。 HEK293では大丈夫なのにHepG2の細胞ではだめとのこと。 細胞は大丈夫でしょうか？ 細胞は同じものを長期間培養し続けると形質が変わることがあります。 私たちも一度経験したのですが、その時新しい細胞を起こすことで解決できました。 別に細胞のストックがあるのでしたら、新しいものを使って試してみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3-8 - 2009/02/11 (水) 15:30:50 - さかて lipofectamine2000では今のところ無いですが、他の試薬では何回かありました。 それほど珍しいことでもないような気がします。 脂質系なので、どうしても品質管理に難しいところがあるのかな。 他の良くはいる細胞で試してもあまりいかないようだったらメーカーに言って、 別のロットをサンプルとして出してもらえばいかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3-7 - 2009/02/11 (水) 14:37:34 - たいあ HepG2へはもともと導入成功していたんですよね。 ロット変えてだめだったらちょっと手詰まり感がでますね・・・。 わたしもHepG2へpGL4を導入しています。TransIt LT1を用いています。

(無題) 削除/引用 No.3-6 - 2009/02/10 (火) 23:18:33 - Hep太郎 >[Re:5] ~さんは書きました : > ラボにGFPなどの蛍光タンパク質を発現するベクターはありませんかね。 > 何かと融合しててもいいと思います。 > > それを入れてみれば、トランスフェクション時の問題なのか、ルシフェラーゼの検出の問題なのかが分かり、 > どのステップの問題なのかが絞り込まれると思います。 ~様ありがとうございます。実はこのようなベクターを持っていないので、残念ですができません。 実は、今日、I社の営業の方に尋ねてみました。 同じロットでおかしいと言った報告はないが、HepG2は元々遺伝子導入しにくい細胞なのでそのような状況であればリポフェクション試薬による可能性も否定しきれないとの返答でした。 ということで、違うロットの試薬でトライしてみることになりました。

(無題) 削除/引用 No.3-5 - 2009/02/10 (火) 08:37:58 - ~ ラボにGFPなどの蛍光タンパク質を発現するベクターはありませんかね。 何かと融合しててもいいと思います。 それを入れてみれば、トランスフェクション時の問題なのか、ルシフェラーゼの検出の問題なのかが分かり、 どのステップの問題なのかが絞り込まれると思います。

(無題) 削除/引用 No.3-4 - 2009/02/10 (火) 07:15:00 - Hep太郎 >[Re:3] おおさんは書きました : > You checked the luciferase kit itself, didn't you? > おお様御指摘ありがとうございます。 ルシフェーラーゼアッセイキットは半年ほど前に開けたものを使用し続けていますので、問題ないかと思うのですが・・・。 >[Re:2] UCさんは書きました : > こんにちは。以前、某社のトランスフェクション試薬を使っていて、業者の方から、どうも特定のロット番号のトランスフェクション効率が悪いから、該当したものがないかと訊ねられたことがあります。たまたま、該当したものがあって、特に変だなと感じることはなく使っていたのですが、新しいものと無料交換になりました。今どき、そういうこともあるもんなんだと思いました。なので、この投稿を読んでいて、試薬の可能性もあるかもと思った次第です。 一度問い合わせてみた方がよいのかもしれません・・・。 すみませんが、引き続きご意見お願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.3-3 - 2009/02/10 (火) 02:33:39 - おお You checked the luciferase kit itself, didn't you?

Re: 削除/引用 No.3-2 - 2009/02/10 (火) 00:11:33 - UC こんにちは。以前、某社のトランスフェクション試薬を使っていて、業者の方から、どうも特定のロット番号のトランスフェクション効率が悪いから、該当したものがないかと訊ねられたことがあります。たまたま、該当したものがあって、特に変だなと感じることはなく使っていたのですが、新しいものと無料交換になりました。今どき、そういうこともあるもんなんだと思いました。なので、この投稿を読んでいて、試薬の可能性もあるかもと思った次第です。

細胞のトランスフェクション実験について 削除/引用 No.3-1 - 2009/02/10 (火) 00:05:31 - Hep太郎 いつも勉強させて頂いています。 皆様のアドバイスを頂きたく、投稿しました。 とあるプロモーター領域をpGL4につないだレポーターベクターを使ってLipofectamine 2000を用いてトランスフェクション実験を行っているのですが、去年の年末あたりからHepG2細胞を用いた実験で突如ルシフェラーゼアッセイで全く値が出なくなりました。 今までと全く同じプロとコールなのですが、全くだめな状態です。 うまくいかなくなってから、 ・手（実験を行う人） ・細胞のロット（別の日に凍結したもの） を変えてもダメ、またレポーターベクターに問題があるかと思い確認しましたが、大丈夫でした（以前に一度にたくさん精製したものを用いています）。また、培地のFBSのロットは最近変わっておらず、さらに同じレポーターベクターをHEK293で用いた実験（同じリポフェクション試薬を使っている）では大丈夫なのです。 このような中で、ほかに思い当たる原因となりうる可能性としては、培地とトランスフェクション試薬を買い換えたことで（培地はGIBCOの同じ種類の培地を使っています）、その中で私が気になっているのは、リポフェクション試薬をちょうどおかしくなる少し前に新しいもの（同じLipofectamine 2000です）を買ったことです。 同じLipofectamine 2000ですが、ロットが変わっています。 そこで、皆様にご意見をお伺いしたいのですが、リポフェクション試薬のロットが原因となってトランスフェクションがうまくいかなくなる可能性はあるのでしょうか？ もしくは何かほかに原因となりうるものがあるでしょうか？ もし試薬が原因なら買い換えないといけなく、結構高いので少々困ることになるなあと思っています。 長々と書きましたが、忌憚なきご意見をお願いいたします。

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