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(無題) 削除/引用 No.3426-6 - 2010/11/26 (金) 13:23:11 - 悩める初心者 A様 お返事遅れて申し訳ありません。 御丁寧に有難う御座いました。 参考にさせて頂きます。 今後とも宜しくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.3426-5 - 2010/11/03 (水) 00:38:52 - A トピ主さんへ すいません。 今更ですが今見直したら以下の組成でDenhardtが抜けてますね。 この組成に1xDenhardtを加えてください。 > Dextran Sulfate 10% > Tris-HCl pH8.0 0.02M > NaCl 0.3M > Formamide 50% > Sarcosyl 0.2% > Yeast tRNA 0.5mg/mL > Salmon testes DNA 0.2mg/mL > > Denhardtの1xが今ではちょっとどういう単位だったのか > 不明です。

(無題) 削除/引用 No.3426-4 - 2010/10/28 (木) 17:20:37 - 悩める初心者 in-situ様、A様 大変ご丁寧なお返事を有難う御座いました。 in-situ hybridizationは、仕上がり至るまでのstepが非常に多いので、 失敗した時に何が原因か判断しにくく難渋しております。 お二方のご意見を参考にして、 安定した結果が得られるまでしぶとくトライしてみます。 今後とも宜しくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.3426-3 - 2010/10/27 (水) 23:33:32 - A 以前in-situ hybridizationと免疫染色を主な実験方法にしている 組織屋さんのラボに出入りして自分でRI-RNAプローブ(約300mer)を 使ってin-situhybridizationして論文にしたことがあります。 その時のハイブリバッファーの組成は以下の通りでした。 Dextran Sulfate 10% Tris-HCl pH8.0 0.02M NaCl 0.3M Formamide 50% Sarcosyl 0.2% Yeast tRNA 0.5mg/mL Salmon testes DNA 0.2mg/mL Denhardtの1xが今ではちょっとどういう単位だったのか 不明です。 プロトコールによるとDextran Sulfate、Tris-HCl、NaClの ３つをまずDEPC水に溶かしてこれが溶けにくいことがあるようで うまく溶けない場合は55度で溶かすようです。それが溶けたのを 確認してからそれ以下のものを溶かして各最終濃度に調整して いたようです。少なくともそのラボが代々出していたin-situ hybridizationの結果はきれいでしたから、この組成は悪くないと 思います。参考になればいいのですが。

(無題) 削除/引用 No.3426-2 - 2010/10/27 (水) 19:01:26 - in situ 両方加えているプロトコルもありますが、どちらか片方でよいと思います。 自分はsalmon sperm DNAを加えています。 RNA-RNA in situ hybridizationは最初の条件検討が結構大変です。 論文に書いてある通りの手順、試薬で行ってもシグナルが出なかったり、バックが非常に高かったり。 自分もここでだいぶお世話になりました。 ただ、いじる点が結構あるので、基本とするプロトコルは必須です。 まずはgoogle scholarとかで論文を検索して、figureがきれいなプロトコルを見つけてみてはいかがでしょうか。

in-sity hybridizationのブロッキングについて 削除/引用 No.3426-1 - 2010/10/27 (水) 18:35:36 - 悩める初心者 いつも大変参考にさせて頂いております。 最近RI標識したRNA probeを用いたin-situ hybridizationに 挑戦中の初心者です。 ハイブリバッファーの作製方法について質問させて下さい。 非特異的なRNA probeの結合を防ぐために、サケ精子DNAやtRNAを加えると 聞いたのですが、それは両方とも必要なのでしょうか？ あるいは片方だけで十分なのでしょうか？ 大変初歩的な質問で申し訳ありませんが、 御教示頂ければ幸いです。 宜しくお願い申し上げます。

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