BioTechnicalフォーラム [制限酵素処理して直接TOPOクローニング]

制限酵素処理して直接TOPOクローニング

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No.3574-TOPIC - 2010/11/24 (水) 20:11:48 - ワニ

あるフラグメントを制限酵素処理して直接TOPOクローニングしたいと考えているのですが
可能でしょうか？
脱燐酸化処理なしでいけますか？
　

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No.3574-11 - 2010/11/26 (金) 08:33:06 - ami

> 勉強になります。
> これなら手間かけてライゲーションするより安上がりかもしれませんね。
> 希釈したベクターの有効保存期間って、ご経験ではどれくらいですか？

TOPO vectorの溶液と同じ組成の希釈液を作って希釈します。どれだけたっても大丈夫でしたが、いちおう少しづつ希釈して-20deg保存ってます。

このフォーラムで書いてあったことです。

(無題)

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No.3574-10 - 2010/11/26 (金) 06:17:17 - ンンノ

>[Re:8] amiさんは書きました :
>
> 貧乏ですがTOPOのベクターはめっちゃ希釈できるので使ってます。ルーチンは50倍。

勉強になります。
これなら手間かけてライゲーションするより安上がりかもしれませんね。
希釈したベクターの有効保存期間って、ご経験ではどれくらいですか？

(無題)

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No.3574-9 - 2010/11/26 (金) 02:39:13 - ワニ

教科書通りに解釈するとできないのは
誰でもわかります

でも普段突出末端同士ならベクターをbap処理せずにライゲーションしますよね
それと似たような感じで
処理なしでいけるのかなあと思っただけです

(無題)

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No.3574-8 - 2010/11/25 (木) 23:57:56 - ami

> TOPOのキットを買ってもらえるほど裕福なラボ

貧乏ですがTOPOのベクターはめっちゃ希釈できるので使ってます。ルーチンは50倍。

(無題)

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No.3574-7 - 2010/11/25 (木) 23:47:34 - ンンノ

PCRプロダクトじゃなくて平滑末端のDNA断片をクローニングしたいんだけど、
ZERO-Blunt　TOPOのキットが使えないかという質問ですよね。
考えましたね（苦笑）

TOPOのキットを買ってもらえるほど裕福なラボなら取り敢えずやってみるのも
ありかと思いますが、amiさんのご指摘のように製品添付書の１ページ目に答え
がほぼ明示的に書いてありますよ。

ホントに何もご自分では調べないんですね。
脱リン酸化しないとクローニング出来ません。
制限酵素消化のときに一緒にいれとけば大丈夫だと思いますよ。

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No.3574-6 - 2010/11/25 (木) 21:45:22 - f

制限酵素で切断後の末端はブラントエンドなんですよね？
もしもスティッキーならば、amiさんの気持ちもわからないでもないですが。
TOPO systemの利点は制限酵素処理なしでのクローニングですよね。

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No.3574-5 - 2010/11/25 (木) 21:36:34 - ワニ

ご返信ありがとうございます
説明書に載ってないと思います
またベクターは切断しないことが前提の話で
ブラントエンドの制限酵素で切ってブラントベクターにライゲーションする場合がどうなのかしりたいです

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No.3574-4 - 2010/11/25 (木) 06:11:26 - Boston-Pullman

TOPO vector もちゃんと制限酵素処理すれば問題ないはずです。当然ライゲース処理しないといけません。セルフライゲーションの可能性があるのであれば、アルフォス処理しないときついと思います。