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(無題) 削除/引用 No.3594-6 - 2010/12/01 (水) 22:02:23 - KOD 横からの質問ですみません。 私もNative-PAGEで悩んでいます。 ミニゲルを用いて、10mA/gelの低電流にして泳動していますが、泳動が非常に遅いというトラブルに悩んでいます。泳動は分離ゲルに入ってから急に遅くなります。ゲル2枚で泳動すると、電圧は20Vになります。 泳動条件は以下のように行い、泳動は全て低温室で行い、試薬も全て低温でそのpHになるように調製しています。 アドバイスをいただければ幸いです。 濃縮ゲル 2.5%アクリルアミド Tris-HCl pH5.5 分離ゲル 5%アクリルアミド Tris-HCl pH7.5 泳動バッファー Tris-Barbital pH7.0 という組成です。

(無題) 削除/引用 No.3594-3 - 2010/11/29 (月) 16:02:20 - netrin ザンギ様 コメントいただきありがとうございます。 そうです、ザンギ様でした私が過去トピで拝見させていただいたコメントも。 実は、今しがたseparating gelをミニゲル板に溢れるほど注ぎ込み、コームをさし、30 minほどしてからコームをはずしました。 すると、土手がちぎれました…（ちなみにSDS-PAGEは何千回もやっておりますので、コームをピッと思いっきり抜いたということはありません…） 難しいですね。初めてなものですから悪戦苦闘しております。

(無題) 削除/引用 No.3594-2 - 2010/11/29 (月) 13:42:52 - ザンギ そう書いたのは自分かもしれませんが、ちょっと説明が面倒ですね。 それでも泳動できると思いますが、それなら分離ゲルで溝を作っても大して かわりません。 また現実的には土手の部分だけゲルをキャストするのは不可能で、土手がち ぎれてしまいます。 Laemmliのバッファー系のポイントは塩の組成の違いにあって、泳動中の 塩類の界面で試料がスタックされます。 Native-Pageはいろんなバッファー系があるので、濃縮ゲルのない系もある かもしれません。自分は知りませんが。 またプレキャストゲルの中には濃縮ゲルと分離ゲルのバッファーを同じく しているものがあります。保存性の向上が目的で利便性はあがりますが、 分離能等はどうでしょうね？

native PAGEでは分離ゲルだけ？それとも濃縮ゲルも必要？ 削除/引用 No.3594-1 - 2010/11/29 (月) 10:48:51 - netrin みなさまお世話になります。 １つよろしいでしょうか？ 私は今後native PAGEを考えておりまして、色々な指南書を読んでいるのですが、 ある本には、native PAGEは分離ゲルのみで行う。 また、ある本には、当然のように濃縮ゲルを分離ゲルの上に乗せる。と書かれてあります。 このBiotechnical forumの過去トピを拝見すると、 「サンプルをapplyするための溝」を作るために濃縮ゲルを使う、とコメントをされている方がお見えでした。おそらく分離ゲルのみではコームで溝を作れないんでしょうか。 以上をまとめると、分離ゲルの上に、濃縮ゲルを乗せるのですが、その目的は濃縮ではなく、溝を作るため、とのことと理解しました。 そこでみなさまに質問です。 以上をふまえ、まずは分離ゲルを通常のSDS-PAGEよりも多めに入れ固めた後、濃縮ゲルを入れ、その後、コームをさします。 この時コームの一番底、つまり溝の一番底と分離ゲルとの間に濃縮ゲルが入る余地がないよう固める、とのことでよろしいでしょうか？ あくまで、濃縮ゲルは溝の「左右の壁」を作るのが目的であり、溝の「底」は直接分離ゲルが接触するようゲルを作ればよろしいということでしょうか？ 分かり難い文章になってしまい申し訳ありません。 もし根本的なところで間違った解釈をしていればどうぞご指摘いただけますと幸いです。

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