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(無題) 削除/引用 No.3667-4 - 2010/12/12 (日) 05:44:53 - おお > おおさんは、GlycineとTrisをいい案配でまぜてgelを作製されたことはございますか？ GlycineとTrisの量を調整してベストな条件を見つけたことはありませんが、ゲルシフトアッセイなどでつかうことがあります。蛋白とDNAの結合を電気えいどうでみるのですが、一種のネイティブ電気えいどうです。 このばあいTGEバッファーが使われEDTAも加えているようですが、除いてもワークします。 レシピはアクティブモチーフのきっととかの説明書とかから取れると思います。物によってバリエーションがあるかもしれませんが、そこまで注意深く見たことがありません。 http://www.activemotif.com/catalog/details/37301/gelshift-ap-1-family-carcinoma.html もう一つはピアスがゲルシフトのきっとを売っていますが、彼らの提示している写真はバンドがすごくシャープです。もしかしたらなにかいい情報が彼らの方法から得られるかもしれません。ゲルシフトはTAEやTBEを使うこともあるようです。パッと見た感じピアスさんの物はそう言うバッファーを使っているのではないかと、、、 http://www.piercenet.com/proteomics/browse.cfm?fldID=7edac33e-3981-4e58-8a57-057a8280c68f 3点思いつくことがあります。サンプルの塩濃度がレゾリューションに影響します。塩が低い方がいいです。 トリスに限らずバッファーの濃度が高い方がえいどう速度が遅くなります。これを利用してえいどうバッファーの濃度の倍程度以上の濃度のバッファーを使えばえいどう速度の違いでスタックされるのでいくぶんバンドがシャープになるかと、、、もちろんスタッキングにえいどうバッファーと同じ濃度、分離ゲルに倍の濃度という風にセットするとより効果的かもしれません。 バッファーのpHはネイティブで行うならアルカリに振るというのがよくいわれています。ポジティブチャージをマスクしてトータルとしてネガティブなチャージをポリべプチどが持つようにするためです。pH8.8のバッファーはある意味理にかなってます。そういう意味でTGEはグリシンを減らして少しアルカリに降ってもいいかもしれません。ゲルシフトはタンパクがDNAと結合してそれでえいどうされればいいわけですから、タンパクだけのレゾリューションにどこまでいいのか分からない部分がありますし。

(無題) 削除/引用 No.3667-3 - 2010/12/11 (土) 21:44:51 - 非還元PAGE おおさま ありがとうございます。 >そのぶんバッファーの濃度を低くしてえいどう速度を上げているのだと思います。 Trisにはそうした作用があるんですね。 結果が先ほど出ました。 結果は、通常のLaemmuli baseでの375 mM Tris-HCl, pH 8.8に比べて、 今回の50 mM Tris-HCl, pH 8.8のseparating gelのband のパターンはそれほど変わりませんでした。やはり以前としてスメア状です。（stacking gelはなしで作製しています。） 比較実験として、Trisの代わりに50 mM Glycine/NaOH, pH8.8を使ってgelを作製しましたが、今後はbandは比較的bandらしくなりましたが、今後はあまりwellからsampleが流れていないようです。 おおさんは、GlycineとTrisをいい案配でまぜてgelを作製されたことはございますか？ 実験本を読んでもこの二つをまぜてgelを作製している方法が見当たらなくて… （ただし、discontinuous gelとして異なる組成のgelを重層させてるものはよく見ます） 困ったなあ。。

(無題) 削除/引用 No.3667-2 - 2010/12/11 (土) 02:15:53 - おお で、うまく行きましたか? 結局はどんなバッファーを使おうともあなたの目的のものがうまく分けることができれば言い訳で、SDSPAGEのバッファー組成はもともとSDS抜きのネイティブな電気えいどうとして開発されていたものを利用したもののはずです。 バッファーの濃度は電気えいどうの速さと関係があります。ネイティブにするとSDSがタンパクに結合してない分だけえいどう速度が遅くなりますので、そのぶんバッファーの濃度を低くしてえいどう速度を上げているのだと思います。どちらがいいかはなんともいえません。そのほかにもいろいろなパラメーターがあるでしょうし。

未変性PAGEと、通常のSDS-PAGEでゲルのトリスの濃度が違うのは？ 削除/引用 No.3667-1 - 2010/12/10 (金) 21:41:16 - 非還元PAGE みなさま私のふとした疑問に少しだけ耳をお貸しください。 Current protocol of molecular biologyの「Electrophoresis using non-denaturing condition」という所謂Native PAGEを読んでいたのですが、 separating gel中のTrisの濃度はfinal 50 mMになります。 一方、通常のLaemmuli SDS-PAGEでのTris濃度は375 mMです。 私はてっきり、non-denaturing PAGEとは、通常のSDS-PAGE protocolから「単にSDSを抜いただけ」と考えていましたので、Trisの濃度まで違うとは大変驚いています。 実はですね、私はこれまでnon-denaturing PAGEを行っていて、「単にSDSを抜いただけ」のgelを作製し、泳動していたのですが、中々上手く行きませんでした。特にbandがスメア状になってしまっていました。 そこで、もしかしたらdenaturing PAGEとは「単にSDSを抜いただけ」のレシピではgelは上手く作れないのではと考え、Current protocol of molecular biologyを手に取ったわけなんです。 （ちなみに上司からはSDSを抜いていつも通りgelを作ればいいと教わっていました。） Trisの濃度が7.5倍も薄くする理由というのは何が考えられるでしょうか？ Trisの濃度を50 mMにしてSDS freeでゲルを作れば上手く行ってほしいのですが、、

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