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(無題) 削除/引用 No.3703-17 - 2010/12/21 (火) 11:33:52 - 類似 すみません。No.3703-16投稿場所を間違えました。無視してください。

Ni-NTA superflow 削除/引用 No.3703-16 - 2010/12/21 (火) 11:31:10 - 類似 Ni-NTA superflowをつかってHisタグ蛋白を精製していますが、バッチ法はとくに問題ありませんか？ （カラム法だと、５０ｍMイミダゾールから200ｍMまでだらだらと溶出されます） また、溶出したHisタグ蛋白を希釈すれば、可逆的にくっつくようになりますか？ 再生は、洗ってNiを加えて問題ありませんか？Niを加えなくても、色は青いままでほとんど変わりません。 どうも目的蛋白が気難しいのか、Hisタグとの相性が悪いのか、思うように行かず困っています。

(無題) 削除/引用 No.3703-15 - 2010/12/21 (火) 09:34:40 - ばいや ポジコンって目的タンパクの商品かと思っていましたが、違うのですか？ 違うのなら、目的タンパクのpIはどうですか？

(無題) 削除/引用 No.3703-14 - 2010/12/20 (月) 14:51:33 - aimar >別ゲルのCBBはバンドが確認されています というのは、CBB染色で目的の位置にバンドがしっかり確認できるということですか？ His tag ラダーというのがどういうものが知らないのですが、抗His tag抗体の種類によってはN末とC末に着けた場合に、検出のされ具合（程度）が違うってことが以前にありました。 おおさんか書かれているように、ラボに他のHis tag がついたコンストラクトってのはないのでしょうかね？ それを使えば、抗体が悪いのかどうかわかる気がするのですが。

(無題) 削除/引用 No.3703-13 - 2010/12/20 (月) 13:11:06 - anan 返信が遅れまして申し訳有りません。 現在、インクルージョンも考慮して不溶性画分の回収も試みています。 ちなみにPVDFではボウズでしたが、別ゲルのCBBはバンドが確認されています。 みなさまのご高配を参考に、もうすこしあがいてみます。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3703-12 - 2010/12/20 (月) 10:05:11 - とりあえず ゲル面積×2mA、定電流で行うのを推奨してるのが多いんじゃないでしょうか

(無題) 削除/引用 No.3703-11 - 2010/12/20 (月) 09:31:01 - おお >[Re:1] ナメック星人さんは書きました : > B：15％PAGEと厚めなので、ブロッティングを長めor電圧高めに行う 小出しですいません。ちなみに25Vというのはセミドライでマキシマムに近いです。バイオラッドのシステムではそれ以上あげるなとかいています。 機械がおかしくなる心配もしたほうがいいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.3703-10 - 2010/12/20 (月) 09:26:41 - おお >[Re:5] ananさんは書きました : > CBB、タンパク検出されませんでした。 > やはりサンプル量（濃度）がひくいのでしょうか・・・ 質問者ご本人でしょうか。 1ug/ulで5-10ulも流せば何がしかのタンパクがCBBなどで検出されるはずです(検出の仕方にもよるとおもいますが)。クルードなもので5-25ugレーンに流すのがたいていのプロトコールだと思います。 精製されたたんぱく質であれば1ug以下で十分です。 HISに対する抗体であればノンスペを拾うことも可也ありますのでバックグランドが全くでないなら、ちょっと検出系もよわいのかタンパクのトランスファーなのかという感触はあります。 ほかに依然あなたのラボや周りのラボでHISx6でタグしたタンパクを大腸菌などでつくっているならそういうのをポジコンにするてはあります。

(無題) 削除/引用 No.3703-9 - 2010/12/20 (月) 07:03:06 - Boston-Pullman IPTGの入れ忘れって事は無いですよね？ それでもリークしたりするので、おおさんが指摘されている様に、不溶性画分にいっているのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3703-8 - 2010/12/20 (月) 04:44:32 - おお えっと、条件をよく見てみると、25Vで50mAですよね。電流が少し少ないのではとおもいます。これはいろいろな条件で決まるので何ともいえませんがもっと低い電圧で4倍ぐらいあってもいいかと思います。10cmx10cmで。これはバッファーにもよるので絶対ではありません。 一つききたいのは、その条件ですでにいろいろ実験したりして確立されたものでしょうか。 トランスファーの後にゲルをCBBでそめると、その条件でトランスファーできているかわかると思います。 ベンコットンは一般的によく使われるのでしょうか、ウエスタンに。 リコンビナントであれば発現誘導して、大腸菌を回収してサンプルバッファーを加え流すと、よく発現しているときは、空のベクターとかと比べて特異的なバンドがCBBでも見られることがまあまああります。 状況をもう少し冷静に検証してみてください。

(無題) 削除/引用 No.3703-7 - 2010/12/19 (日) 18:14:45 - と 昔20kDaのタンパクがブロッティング時間が長すぎたせいで検出できなかったことがあります ブロッティング時間を短くしてみたらどうでしょうか？ PVDFをCBB染色するんじゃなくて、別のゲルで泳動したものをCBB染色すれば見えるんですよね？

(無題) 削除/引用 No.3703-6 - 2010/12/18 (土) 13:31:46 - おお それなら、どの様にして発現しているか評価して、不溶かくぶんにいっていないことを確認されたのでしょうか。 それとも不溶かくぶんのものは使えないので仕方がなくそうやっているのでしょうか

(無題) 削除/引用 No.3703-5 - 2010/12/18 (土) 13:10:28 - anan CBB、タンパク検出されませんでした。 やはりサンプル量（濃度）がひくいのでしょうか・・・

(無題) 削除/引用 No.3703-4 - 2010/12/18 (土) 10:42:42 - ナメック星人 回答ありがとうございます とさん こちらは明記してませんでした。すみません、23kDaです。 おおさん サンプルは、ソニケーターで破砕した可溶画分です。 それを定量して濃度は1μg/μlです。

(無題) 削除/引用 No.3703-3 - 2010/12/18 (土) 02:06:08 - おお あなたのサンプルは精製したたんぱくなのか、ライセートなのか。 流したタンパク量はどれくらいあるのか。 ラダーと比べ期待されるシグナルの強度は(もしかしたらそのラダーのレーンが真っ黒なスメアーになるくらいやくとバンドが見えるかもしれません)。 ちょっと情報が欲しいところです。ブロッティングについてはラダーがブロットされてますからそれを基準に考えると良いと思います。同じクラいの分子量のマーカーが効率よくトランスファーされているなら条件をあまりいじる必要性がないと思いませんか?

(無題) 削除/引用 No.3703-2 - 2010/12/17 (金) 20:46:21 - と 分子量はいくつですか？小さいならブロッティング時間を短くしないといけません

His-tagタンパク、ウェスタンブロット 削除/引用 No.3703-1 - 2010/12/17 (金) 19:32:04 - ナメック星人 ウェスタンブロット法により、Hisタグ融合タンパクのバンドを確認する実験を行っています。 手順は↓ 1．SDS-PAGE電気泳動（8×8ミニゲル） 2．ベンコットン×3、ゲル、PVDF、ベンコットン×3積み重ね、セミドライ式でブロッティング@25V　50mA　1Wにて40min 3．TBS-T洗浄30min 4．一次抗体反応O/N 5．翌日TBS-T洗浄30min 6．二次抗体反応1hour 7．TBS-T洗浄15min 8．発色反応→確認 です。 ポジコンも含め、用いた某社のHis-tagラダーは発色したのですが、サンプルのうち目的のHisバンドが発色しませんでした。 考えている原因、改良策としては↓ A：サンプルの濃度が低い B：15％PAGEと厚めなので、ブロッティングを長めor電圧高めに行う 現在確認に用いたPVDFに、CBB二次染色を行っています。 全タンパクを確認できれば少しずつ改良法は見えてきそうですが…。 まだまだ知識も考察力も浅いので恐縮ですが、ご意見をお寄せ頂ければ嬉しく思います。よろしくお願いします。

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