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(無題) 削除/引用 No.3719-3 - 2010/12/21 (火) 19:41:19 - 類似 おおさん、詳しいコメントをありがとうございます。 少し前にあったトピと類似して、濃縮不能な蛋白（？？）でバッチ法が効くならいいのですが、ぜひ試してみようとおもいます。 濃縮不能というのは、硫安でダメ（沈殿しない）、アミコンでもダメ（膜に吸着？？）といった調子です。 沈殿していないし、基質になるのであぐってはいないようです。

(無題) 削除/引用 No.3719-2 - 2010/12/21 (火) 14:12:22 - おお >Ni-NTA superflowをつかってHisタグ蛋白を精製していますが、バッチ法はとくに問題ありませんか？ ものをくっつけて、溶出するという点では問題ないと思います。 バッチのほうが収量が劣るという方もいらっしゃいますが、やり方次第でそうでもないのではと個人的にはおもってます。 >カラム法だと、５０ｍMイミダゾールから200ｍMまでだらだらと溶出されます 35-40mMで洗い一気に200mMに上げる手もあると思います。 ５０ｍMイミダゾールから200ｍMでいちどようしゅつして、希釈後再吸着して、200mMで溶出でもいいかもしれません。 >溶出したHisタグ蛋白を希釈すれば、可逆的にくっつくようになりますか？ 一般的には(よほど変なことが起こってない限り)ワークします。 >再生は、洗ってNiを加えて問題ありませんか？ 500mMぐらいまでイミダソールを持ち上げて、吸着している可能性のものをなるべく完全に溶出して、次の精製に使うといいかと思います。 汚れがありそうでしたら、ウレア、グアニジンなどで洗浄という手がありますが、たいていは毎回必要ないと思います。Niはイミダゾールで溶出する限り毎回チャージする必要も感じません。 >５０ｍMイミダゾールから200ｍMまでだらだらと溶出 これの原因がわかった方がいいようなきがします。 あぐりげーしょんとかでいろいろな溶出特性をもったものが存在するのであれば、そう言う蛋白でいいのか、あるいはどのフラクションにあぐってない物がきているのか、そのフラクションを増やすためにはどうしたらいいかなど、、、 ただ原因はあぐりげーしょんとは限りませんけど。なにか活性がはかれるならそれを指標にできますね。

Ni-NTA superflow 削除/引用 No.3719-1 - 2010/12/21 (火) 11:32:02 - 類似 Ni-NTA superflowをつかってHisタグ蛋白を精製していますが、バッチ法はとくに問題ありませんか？ （カラム法だと、５０ｍMイミダゾールから200ｍMまでだらだらと溶出されます） また、溶出したHisタグ蛋白を希釈すれば、可逆的にくっつくようになりますか？ 再生は、洗ってNiを加えて問題ありませんか？Niを加えなくても、色は青いままでほとんど変わりません。 どうも目的蛋白が気難しいのか、Hisタグとの相性が悪いのか、思うように行かず困っています。

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