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失礼しました。 削除/引用 No.3726-20 - 2010/12/27 (月) 10:27:06 - mom-a 英数字から日本語入力へ切り替えたところでどこかに触ったのでしょう、送信されてしまいました。 TK-1さん、敬称抜きになってしまって申し訳ありません。 完全版↓ TK-1さん 私はNo.3726-8のBoston-PullmanさんやNo.3726-13のンンノ 意見とは違って、 ターゲットの「コピー数が多すぎる」ことが検量線が直線にのらない原因だとは「思わない」、 ということを言いたかっただけです。 どうやら、あまりよい説明ではなかったようです。

TK-1 削除/引用 No.3726-19 - 2010/12/27 (月) 10:24:52 - mom-a 私はNo.3726-8のBoston-PullmanさんやNo.3726-13のンンノ 意見とは違って、 ターゲットの「コピー数が多すぎる」ことが検量線が直線にのらない原因だとは「思わない」、 ということを言いたかっただけです。

(無題) 削除/引用 No.3726-17 - 2010/12/25 (土) 09:56:25 - ンンノ >[Re:16] よしえさんは書きました : > 周りに聞く人がおらず、研究室内でも私が立ち上げているようなものなのでいろいろなご指摘助かります。また『このような考え方もしたほうがいい』というようなこともありましたら教えていただけると自身の勉強にもなりますのでよろしくお願いします。 回答者のみなさんは、質問者の問題を解決することで自分自身の経験値をあげ ようと（潜在的に）思っています。 質問内容ややりとりの中でみなさんが不明確な点を確認したいと思っています ので、それについて説明してください。

(無題) 削除/引用 No.3726-16 - 2010/12/25 (土) 03:45:19 - よしえ 皆様、年の瀬のお忙しいところご指摘ありがとうございます。 （実は今週めずらしく風邪をひいておりましてなかなか仕事とコンピュータに集中できずにおります。） 周りに聞く人がおらず、研究室内でも私が立ち上げているようなものなのでいろいろなご指摘助かります。また『このような考え方もしたほうがいい』というようなこともありましたら教えていただけると自身の勉強にもなりますのでよろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.3726-15 - 2010/12/24 (金) 22:27:02 - TK-1 > >2）0.5マイクログラムのRNAからRT-PCRよりcDNAを作製 > > ここは、「RTしてcDNAを作製」の書き間違いだと思っていました…。 今更こんなことを指摘しても無意味なような。多分トピ主以外はわかっているでしょうし、トピ主もただ打ち間違えただけでしょう。 > ちなみに、私はプラスミドベクターでよく検量線を作りますが、コピー数にして10の3乗から8乗までは問題なく直線にのります。 大昔に議論になったと思いますが、水で希釈したプラスミドでスタンダードを引いても、目安にはなっても現実を反映しているわけではない。かなりいい加減にプライマーを作っても、かなりいい加減に条件を設定してもプラスミドならシングルバンドでPCRはかかるんです。100%pureなテンプレートだからです。でも同じ条件でバルクのcDNAなどのゴミがいっぱいあるテンプレートでやるとそうはいきません。プライマーがミスアニールしたり、あるいはターゲット以外にもアニールしたりして効率が変わってくる。 ところでトピ主さんは何で出てこないんでしょう。クリスマス休暇？もし話について来れないというのなら、教科書を読むところから始めて下さい。

(無題) 削除/引用 No.3726-14 - 2010/12/24 (金) 20:21:26 - mom-a >標準鋳型を作るRT-PCRで仮に３０サイクルも回してるとすると、計算上は >１０億倍くらいの鋳型濃度になってますから、被験試料ではありえない濃 >度になります。 >この濃度ではみなさんが説明しているような理由で測定値もズレやすくなる >ので測らなくてもいいと思います。 >RT-PCR産物を精製して濃度を決めてから使うのがよろしいかと。 私の方が勘違いしているのでしょうか？ >2）0.5マイクログラムのRNAからRT-PCRよりcDNAを作製 ここは、「RTしてcDNAを作製」の書き間違いだと思っていました…。 いずれにせよ、検量線（になってない感じですが）の最高濃度でのCt値は22.7とか22.75ですから、濃すぎるという感じではないように思いますが。 ちなみに、私はプラスミドベクターでよく検量線を作りますが、コピー数にして10の3乗から8乗までは問題なく直線にのります。

(無題) 削除/引用 No.3726-13 - 2010/12/24 (金) 18:43:03 - ンンノ 標準鋳型を作るRT-PCRで仮に３０サイクルも回してるとすると、計算上は １０億倍くらいの鋳型濃度になってますから、被験試料ではありえない濃 度になります。 この濃度ではみなさんが説明しているような理由で測定値もズレやすくなる ので測らなくてもいいと思います。 RT-PCR産物を精製して濃度を決めてから使うのがよろしいかと。 ところで、 >[Re:10] おおさんは書きました : > >[Re:5] TK-1さんは書きました : > > > もちろんこれは理論上でのことですが、0.7, 1.25, 0.95, 1.4とかっていうのはひどすぎませんか。 > > 全部検量線から外れていると見た方がいいような気がしてきた。。。相関性があるだけみたいな。 > > 僕も検量線以前のレベルの問題を解決するのが先かと思います。 定量PCRの測定誤差には色んな要素がありますが、実験者の技術レベルによる ところがかなり大きいようです。

(無題) 削除/引用 No.3726-11 - 2010/12/24 (金) 18:20:27 - mom-a カットオフをどこでするかによってCt値が異なってきますが、 「Y軸を対数にした時に直線性のある範囲で、比較的曲線の立ちあがりに近い位置」をスレッショルドに設定するとします。 経験的には、この状態であれば、Ct値10〜30までは鋳型量が多すぎも少なすぎもせず、良好な（直線性が良く、傾きが適切な）検量線が書ける範囲であると思います。 トピ主さんのNo.3726-4 場合は、適切なPCR条件ではないのでは？融解曲線の確認はしましたか？私なら、（他に何か目立った問題があれば別ですが）PCR条件設定をやり直すのではないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.3726-10 - 2010/12/24 (金) 17:55:33 - おお >[Re:5] TK-1さんは書きました : > もちろんこれは理論上でのことですが、0.7, 1.25, 0.95, 1.4とかっていうのはひどすぎませんか。 全部検量線から外れていると見た方がいいような気がしてきた。。。相関性があるだけみたいな。

(無題) 削除/引用 No.3726-9 - 2010/12/24 (金) 16:33:13 - Pumpkin 希釈していないというのが出発RNA量にしてどのくらいの量なのかわかりませんが、希釈無から3倍づつ希釈して計測しておられるので、これがスタンダードカーブを取っているということで理解して話を進めます。 希釈しない場合、高濃度に鋳型が存在する場合はPCRの増幅がうまくいかずにPCR効率が落ちることがあります。また、希釈しすぎて鋳型が極端に少ない時もまたしかりです。 ですので、スタンダードカーブを描いて内部標準もターゲットの遺伝子も直線性のある鋳型濃度でQPCR解析を行うべきなのです。だから、希釈していないという点は定量性が確保できないので、そこでは計らないということになります。例えば、RNA出発量として100ng, 10ng, 1ng, 100pg, 10pg位でそれぞれ計測して、直線性が問題なければその範囲で相対値を求めればよいわけです（10ngで計って相対値をだすとか）。 スタンダードカーブを書くとPCR効率も出せますから、これが100%に近い値をとるときは直線性としても良好といえるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.3726-8 - 2010/12/24 (金) 07:11:11 - Boston-Pullman ターゲットのCtは30ってとこでしょうか？ ターゲットがうまくいくのはcDNAコピー数が程よいからだと思います。 逆に言えば、スタンダードのコピー数が高すぎます。 手間かもしれませんが、PCR productを精製、定量して（この時点で溶液中の総モル数がわかります）、その溶液を段階希釈して、Ct値とコピー数の検量線を引くことを勧めます。 その検量線に乗るようなcDNA溶液の希釈を見つけ出せば、得られたCt値からコピー数が算出されます。 スタンダードのコピー数当りのターゲットコピー数も計算できます。

(無題) 削除/引用 No.3726-7 - 2010/12/24 (金) 07:01:47 - TK-1 希釈云々を議論するのもいいですが、例えば希釈しないと言っても、PCR反応液全体に対して加える量はいくらとかその辺で最終的にどれだけのRT-BUFFERの持ち込みがあるか変わる訳です。単純な話、10ulの系で希釈しないで0.2ul加えるのと５倍希釈して1ulを加えるのは違いがないわけで、どれだけ加えるかも考えないで、希釈がどうのこうのという話をしても意味がない訳です。サイエンスの話ですからもうちょっときっちりやりませんか。 それに検量線が直線になったからと言っても、PCRの効率がそれなりのRANGEで90-110%くらいに収まらなければ定量性という意味では問題があるような気もしますが。

(無題) 削除/引用 No.3726-6 - 2010/12/24 (金) 06:25:34 - よしえ ありがとうございます。 希釈していないcDNAが検量線からはずれてしまったようなご経験はないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3726-5 - 2010/12/24 (金) 05:39:35 - TK-1 linearityもひどいですが、PCR効率もバラバラと言うかもう少しきっちりと条件を決めた方がいいんじゃないですか。 ３倍希釈にしたら、Ct値は1.73大きくなります。次にさらに３倍希釈したらCt値は1.73大きくなります。もちろんこれは理論上でのことですが、0.7, 1.25, 0.95, 1.4とかっていうのはひどすぎませんか。

(無題) 削除/引用 No.3726-4 - 2010/12/24 (金) 04:46:49 - よしえ nnn様、Boston-Pullman様、 早速のアドバイスありがとうございます。Ct値ですが、 Plate 1 cDNA 1 - Ct値 22.7 cDNA 1/3 - Ct値 19.3 cDNA 1/9 - Ct値 20 cDNA 1/27 - Ct値 21.25 cDNA 1/81 - Ct値 22.6 Plate 2 cDNA 1 - Ct値 22.75 cDNA 1/3 - Ct値 19.65 cDNA 1/9 - Ct値 20.35 cDNA 1/27 - Ct値 21.3 cDNA 1/81 - Ct値 22.7 このような結果でした。

(無題) 削除/引用 No.3726-3 - 2010/12/23 (木) 15:42:41 - Boston-Pullman 希釈していないcDNAを使った時のCt値はそれぞれどの位ですか？

(無題) 削除/引用 No.3726-2 - 2010/12/23 (木) 12:43:54 - nnn 経験上、ほとんど希釈しない時、検量線から外れる事はあります。 qPCR反応液に対して、RT反応液の持ち込み量が多い事が考えられます。 Ct値が見かけ上、大きくなる時は（より遅いサイクル数で検出） ターゲットとなるmRNAの発現量が多すぎて、qPCRのプライマーとの濃度比が悪く、 初期のサイクルでうまく反応出来ていないのか、 反対にCt値が見かけ上、小さくなる時は（より早いサイクル数で検出） RTに用いたプライマーの持ち込み量が多くなり、SYBR Greenの系でバックグラントを高めてしまっているのかと。 いずれにせよ、検量線にのらない希釈率では、本番のサンプル解析は行わないようにしています。 （その為の予備実験ですし。）

リアルタイムPCRの検量線　はずれ値 削除/引用 No.3726-1 - 2010/12/23 (木) 09:03:25 - よしえ 現在リアルタイムPCRをやっております。 1）培養細胞からtotal RNAを抽出 2）0.5マイクログラムのRNAからRT-PCRよりcDNAを作製 3）できたcDNAを3倍希釈し、これを4回繰り返す。（1, 1/3, 1/9, 1/27, 1/81） このサンプルでリアルタイムPCRの検量線を引く練習をしました。 用いたプライマーはQ社から購入したもので、サイバーグリーンを使用しました。（同じくQ社） プライマーは私が用いたいターゲットとGAPDHの二つで練習しました。 ターゲットについての検量線は1から1/81までほぼ直線になったのでホッとしたのですが、GAPDHについてトラブルがありました。cDNA1/3から1/81までですとほぼ直線になるのですが、cDNA1のときのCtの値が大きくなってしまいます。 次に、1マイクログラムの先ほどと同じtotal RNAよりcDNAを作製し、これから3倍希釈を5回繰り返したサンプルで試してみました。（1, 1/3, 1/9, 1/27, 1/81, 1/243）同じくターゲットとGAPDH、あと18Sプライマーも新たに購入し、これら3種類で試してみました。 ターゲットの検量線はほぼ直線になりましたが、GAPDHと18Sの検量線はやはり希釈をしていない場合のCt値が大きくなりました。（1/3から1/243まではほぼ直線になる。） 数回練習をしたのですが、いつもこのような結果となってしまいます。その外れた1点を除外すれば一応相対計算はできるのですが、ナゼこうなるのかピンときません。手持ちの本やネットでも調べてみたのですがわかりませんでした。どなたかこのようなご経験がある方、また詳しい方がいらっしゃいましたらご教示いただけないでしょうか。 よろしくお願いします。

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