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(無題) 削除/引用 No.3729-6 - 2010/12/26 (日) 01:20:31 - 困った みなさまご教示ありがとうございました！ 大変助かりました。 当方、SDS-PAGEにはかれこれ7年ほど従事しており、手慣れたモノなのですが、 最近SDS-free PAGEを行うことになり、separating gelのみでゲルを初めてつくることになった次第です。 ですが、なかなか分離ゲルだけでwellを作るのは激しく大変な作業でしてかれこれゲル作製で６回ほど失敗しております。 今回、私が成功に至った方法というのは、多くの方からのコメントにもあったように、コームを出来るだけ奥に差し込み、コーム自身でシールするという方法を取りました。この際、水、ブタノール、イソプロ等使用しませんでした。ですが、20分ほど室温で静置しましたら、うまく固まりました。 みなさま大変助かりました。 これで上手くいかなければAPSやTEMEDの濃度をアドバイスにもありましたように高めようと考えておりましたが、幸いこれだけで上手く行きそうです。 この度はみなさま貴重なご意見ありがとうございましたm(__)m

(無題) 削除/引用 No.3729-5 - 2010/12/25 (土) 18:04:29 - ゲル アクリルアミドが低いとそうなりますね。ゲルが少し縮むせいです。対策は、おおさんの書かれたようになるべくコームを一杯まで差してというのと、そのうえにさらに溶液を盛り上げることと、それでもだめなら、一度重合させてから、未重合のを除いて、もう一度同じ組成のゲル溶液を少量のせて足りない部分を埋めること、です。このときはゲル濃度を上げてもいいし。ただ、このやり方、結局、分離ゲルをコームの下に水を重層してつくって、同じ濃度のゲルをコームを差してつくる（これだと縮む量が少ないのでwellができます）のとおんなじですが。

(無題) 削除/引用 No.3729-4 - 2010/12/25 (土) 17:55:55 - Actias 僕の標準的なSDS-PAGEゲルの場合、 分離ゲル 10 ml 10% APS 50 ul TEMED 10 ul スタッキング 3 ml 10% APS 50 ul TEMED 8 ul スタッキングにコームを差した後は、水も何も足していません。 そのままです。 トピ主さんの場合だと、僕のよりはTEMEDが少ないです。 でも、それが原因では無いと思います。 Protogel っていうのは、市販品ですか？だったら、ビスアクリルアミドの入れ忘れは無いですね。長く使っていると、アクリルアミドがヘタっているかも。 APS は新しく溶かしていますか？ 溶かしてから長いと、固まりにくくなります。 できれば、その都度、溶かすのがいいですが。 ゲルは温めると早く固まります。で、とっても寒いお部屋で固めてませんよね？

(無題) 削除/引用 No.3729-3 - 2010/12/25 (土) 17:44:47 - と TEMEDとAPSを増やしまくったらどうでしょうか、普通のゲルで早く固めたいときにはそうやってます

(無題) 削除/引用 No.3729-2 - 2010/12/25 (土) 16:04:01 - おお コームをもう少し奥までさして、コーム自身でシールしてしまうってのはどうでしょうか。システムによってはできないかもしれませんが、、、 固まるのが遅いとかないでしょうか、、、脱気などするとよく固まります。若干多めにAPを入れるというのもありですが、、、 コームを刺してから37度のインキュベーターとかにほりこむとか、、、重合前に温めると早くなります。 スタッキングげるはそれよりも薄くて固まりにくいのに、同様に固まるのですからそんなに難しくはないはずです。 くわえて私はスタッキングにはブタノールとかいっさい使いませんので、分離ゲルだけの場合でもほぼ同様でできるはずと思うのですが。 温めるとブタノールは飛びやすくなるかもね。

PAGEで、分離ゲル（running/separating gel）だけで泳動したい。 削除/引用 No.3729-1 - 2010/12/25 (土) 15:31:25 - 困った みなさまお助けくださいm(__)m 先日から分離ゲルのみでゲルを作製し、PAGEを行っておりますが、 なかなかゲルのwellが上手にできません。 DW 4 ml 2M Tris-Cl, pH8.8 2 ml Protogel (30 %) 2 ml 10 % APS 40 ul TEMED 4 ul で、作製し（7 % gel）、30 minほど置いています。ミニゲルです。 コームを外すと、wellが固まっておらず、非常に貧相なwellになってしまいます。 作製するにあたり何かコツ等ありましたらおしえていただけませんか？ ちなみに、ゲルの上にもやはり水かイソプロ等で重層すべきですよね？ 過去の書き込みではgelは空気に触れていると固まり難いとありましたから。。 コツ等ありましたらご教示くださいm(__)m

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