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(無題) 削除/引用 No.3896-5 - 2011/01/28 (金) 21:35:10 - Actias ２番目は、バンドの改善にさほど貢献しません。 シグナル強度は、染色体DNAが律則だとすると、DNA量に比例します。 シグナルが2倍になっても、現状ではバンドとして見ないでしょう。 では、10倍では？と考えたときに、10倍量を泳動できるでしょうか？ それは無理です。 それよりラベル取り込み率のいいプローブを得ることが大事です。 RIのときでもDIGのときでも同じで、 標的に100%ハイブリしたとしてその標的量でシグナルが見えるか？ という観点で段階希釈のスポットでプローブを検定すべきです。 nanaさんが仰る 1コピー分に相当するプローブ（ラベル前）を一緒に流し のところです。

(無題) 削除/引用 No.3896-4 - 2011/01/28 (金) 12:01:34 - まっと 回答ありがとうございます！ はい、バンドが検出されませんでした。（←一番かんじんなコトなのに…） バックグラウンドはないぶん、ブロッキングは問題ないと言われました。 おっしゃる通り、DIG抗体です。 そうですね、まずはプローブのスポットチェックから検討します。

(無題) 削除/引用 No.3896-3 - 2011/01/28 (金) 11:55:14 - nana いくつか分からないことがあるのですが．．． 結局、問題はバンドが検出されなかったということでしょうか。 おそらくDIGラベルしたプローブをハイブリさせ アルカリ性フォスファターゼかなにかでラベルした抗DIG抗体を使い 発色基質で検出ということですよね。 まず、ポジティブコントロールが必要です。 とりあえず、プローブに使ったラベル前のDNAを希釈して メンブレンにブロットして試してみましょう。 お使いのゲノムDNAの1コピー分に相当する量で検出できる必要があります。 それがうまくいったら、今度は、 1コピー分に相当するプローブ（ラベル前）を一緒に流しまて ポジティブコントロールにしましょう。 また、発色反応というのは、途中で何度か確認して、 ほどよい所で止めるものではないかと思うのですが、いかがでしょう。 （発光基質しか使ったことがないのでわかりませんが） 他にも色々改善点はありそうですが．．．

(無題) 削除/引用 No.3896-2 - 2011/01/28 (金) 11:52:04 - 小言幸兵衛 で、何が問題だったんですか？

サザン解析…苦悩！！！！ 削除/引用 No.3896-1 - 2011/01/28 (金) 11:37:36 - まっと サザン解析にて目下奮闘中です。 （手順） ・0.8％AGEにて電気泳動→メンブレンへブロッティング16時間 ・ブロッティング後のゲル確認→バンドは無くメンブレンへの転写はできたと判断した。 ・80度で2時間ベーク ・ハイブリ（20時間） ・翌日、バッファーで洗浄した。 ・ブロッキングを90min行った。 ・抗体反応を30min行った。 ・発色液をラップ上に流し、直接メンブレンを浸して遮光放置した。 自分が帰宅後にも研究室に残っていた先輩曰く「2時間くらい経ったときには（発色液が）乾ききってたで〜」とのことでした。 蛇足でしたが、このこと↑は関係あるのでしょうか？たしかに今の時期、寒いから研究室はガンガンに暖房はかかって乾燥してますが… 今後は… �@ 自作プローブを希釈別にスポッティングして、その発色感度を検出する �A 染色体DNAの濃度を多めに、再度電気泳動〜ブロッキング �B 発色液に浸水後、乾燥蒸発を避けるため真空パック中などで遮光放置 を行う予定です。 よろしかったら、改善に向けたご意見、ご感想いただけますか？ ぜひよろしくお願いします。

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