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締め切られているあとで申し訳ないですが 削除/引用 No.832-14 - 2009/07/23 (木) 21:18:40 - C 済　にされているのにすみません。 まとめてゲル抽出してはいけないのですか？ うちではカラムでゲル抽していますが、バンドの濃さから換算して カラム結合量のキャパを超えていないようであれば複数バンドまとめて ゲル抽することもあります。 たとえば、非常に近いところに複数バンドが詰まっているなら一片の ゲルピースにまとめてしまってその先進めるということです。 幅1cmとかになってしまうときもあります。 サイズが大幅に違うようなら、大きい方のクローンが 取れづらくなったりするので別々にやっています。 最悪エタ沈とか。 変なちっちゃいのが後にかなり邪魔になりますが、 あとは、根こそぎいろんなクローンを取りたいということであれば ライゲーションに持ち込む前のサンプルの検討に加えて トランスフォーメーションをヒートショックでなく エレクトロポレーションにすることで取れるクローン数は増えます。 プレート数も増やして、トランスフォーメーション後の菌液を全て蒔ききります。 ただしコロニーを得た後のスクリーニングがかなり手間です。 ゲル抽出したものでも、なんだこのサイズ？ってものが取れることも（私の場合は）あります。 特にゲルを複数バンド分広めに１ピースを切り出している時は。 それが求めているものか否かは運ですが。

(無題) 削除/引用 No.832-13 - 2009/07/10 (金) 14:53:56 - 縮重中 う　さんありがとうございます。 カラムの性質を一度見直してみますね。 複数のバンドを混ぜてクローニングする際には、物質量の比に留意するようにしてみます。 たくさんのご指摘ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.832-12 - 2009/07/09 (木) 20:25:36 - う １、カラムを通すとなくなるバンドの件 ・カラムの使い方（特に回収方法）を要検討 ・明らかに他のバンドに比べて少なくなるものがある→もともとバンドに見えた「クズ」の集まりだった可能性（特に小さいバンドの場合） ２、複数のバンドを含むPCR産物を１つのカラムで精製できないか ・普通にできると思います。カラムによっては「〜bp以上を精製します」というものがあるので 自分のDNAのサイズに注意する。 ３、複数種類のDNAを一気にクローニングする ・普通にやれると思います。しかし、ライゲーション、及びトランスフォーメーションは 「確立」に支配されるところが多いため、AとBというDNAが100対１の割合で含まれている場合 Aしかクローニングできない、ということがあり得ます。 あまりに各々のDNAの存在比が違いすぎるのであれば、それぞれをゲルから切り出してクローニングを試みた方が、つかまえやすいと思います。わかりますでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.832-11 - 2009/07/09 (木) 19:40:42 - 縮重中 う　さん＞ その２つが伝えたかったことです。 加えて、複数のバンドを含むPCR産物を１つのカラムで精製できないか、ということも質問したかったことです。 伝わりにくい文章ですみません。 -　さん＞ 15ulでは溶出されず残ってしまうのですね・・・ 今後は30ul以上で溶出するようにします。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.832-10 - 2009/07/09 (木) 18:05:13 - - Promegaのあのキットは30ul以下で溶出しようとしても、ほとんど溶出されず カラムに残ってしまいます。 溶出後のDNA濃度をなるべく濃くしたいのはわかりますが、 最低30ulで溶出した方がいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.832-9 - 2009/07/09 (木) 16:45:36 - う >溶出後のDNA溶液を5ul流しても、アガロース電気泳動ではPCR産物よりも少量のバンドが、しかも非常にうっすらとしか確認できなくなってしまいました。 つまり、１つ目は「カラムに通すと消える（薄くなる）バンドがあるということ、と ＞複数のPCR産物を一度に精製できる方法をご存じの方がいらっしゃいましたらご教授や指摘を頂けないでしょうか。 ２つ目は、「複数のバンドを含むPCR産物を１つのチューブの中で一気にライゲーションできないか？」 ということでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.832-8 - 2009/07/09 (木) 15:31:56 - 縮重中 みなさま、たくさんのご意見ありがとうございます。 中年さん＞ ”縮重”でしたね。失礼しました；； かすかにバンドがみられる程度でもクローニングに使えるのですね。 勉強不足でした。ありがとうございます。 う　さん＞ 文章が乱雑ですみません。 質問の要点としては、例としてですが PCRを行った結果、それぞれ個別のものと思われる3本のバンドが出たとして、 それらをまとめて一度に精製する方法はないでしょうか？ ということです。 実際はもっとたくさんのバンドが出ているため、クローニングにコストがかかりすぎるため、一度にできないだろうか？と考えている次第であります。 初めからこう聞けばよかったですね； ~さん＞ 何度もレスいただきありがとうございます。 カラムのキャパシティーの問題を考慮していませんでした。 サンプル数を搾り、切り出し精製によって交雑物を減らしていこうと思います。 エチブロ以外の検出法も考慮してみます。

(無題) 削除/引用 No.832-7 - 2009/07/09 (木) 15:00:15 - ~ 縮合中さんが全部回収したいと言うのであれば止めません。 新しい遺伝子が見つかる可能性を摘み取るメリットもありませんし。 泳動写真が無いので分かりませんが、 wizardのカラムでは55bpあたりから結合しますので、 非特異な低分子の増幅産物があるとしたら、それにカラムのキャパシティーを食われているのかもしれません。 また、カラム精製後のチェックをPAGEゲル＋サイバーグリーンでやってみましょう。 感度が高いですので、エチブロで見えなくても見れる場合があります。 （UVトランスイルミネーターでも見れると思います） 見えるだけで、収量や収率があがるわけではありませんが、見えると安心するでしょう。 ただ、バンドが見えているのがあるので、丸ごと回収してもそのバンドや、低分子のごみを多数拾ってくると思います。 低分子は切り出しで除けます。 そのため、PCR産物の電気泳動、切り出しを薦めます。 バンドの配列を個別に回収、シークエンシングしておいて、 バンドの配列（の一部）を用いてコロニーハイブリダイゼーションなどでバンドの配列を持たないコロニーを取得すると効率がいいと思います。 ホモログなので使えるユニークな配列が無い場合は、制限酵素地図で異なるパターンのものを探せるかもしれません。 何か既に取得したクローンを差し引く方法を考えて、サンプル数を搾っていかないと、 ただ闇雲に読み続けてもきりが無いでしょう。

(無題) 削除/引用 No.832-6 - 2009/07/09 (木) 14:21:32 - う 結局何が問題なのかよくわかりません、読解力がないもので。 ＞できるだけ多くの(コピー数が少なくバンドに検出されなかった配列もあるかもしれないので)配列を回収する狙い ということは、 ＞得られた産物をアガロースゲル電気泳動で確認したところ、目的のホモログ遺伝子と考えられるバンドが複数検出された この複数のバンド以外、つまりほとんど目に見えないバンドを回収するということが目的なのでしょうか？ それならば、カラムに通す以上、 １、元々少ない量である上に、多少のロスはあるわけだからからしょうがない、と考えるのか ２、カラムの使い方（溶出が）が間違っている、と考えるのか ２である可能性は、もともとはっきり見えるバンドの量をカラム処理前と後を相対的に考えて 回収量が妥当か？ということを考えた上で、 少ない量のバンドの回収について考察すればわかると思いますが。 そういう風に考える私には ＞やはり、PCR産物を精製し、全てのDNA断片をクローニング可能な量だけ回収することは不可能なのでしょうか。 検出されたバンド付近でゲルを切り出し精製することも考えていますが、もし複数のPCR産物を一度に精製できる方法をご存じの方がいらっしゃいましたらご教授や指摘を頂けないでしょうか。 よくわかりません。

(無題) 削除/引用 No.832-5 - 2009/07/09 (木) 14:17:21 - 中年 ~さんの仰ることに尽きるのですが、もう一つ付け加えるなら、たとえうっすらでもゲル上で見えるだけのDNAがあれば、クローニングには十分お釣りが来ますよ。 それから、「縮重」プライマーですね。

(無題) 削除/引用 No.832-4 - 2009/07/09 (木) 14:17:19 - 縮合中 ~さん、ありがとうございます。 カラム精製の手違い確認のため、単一のバンドしか検出されないPCR産物でも同様の作業をしてみたのですが、そちらでは問題なく回収後のDNA溶液からもバンドが検出できたので、操作ミスはないと思うのですが・・・ やはり、バンドが濃い部分を切り出して精製するのが一番でしょうか。

(無題) 削除/引用 No.832-2 - 2009/07/09 (木) 13:54:18 - ~ 単にカラム精製がうまくいっておらず、 カラムの使い方を確認するのがいいと思いますが。 また、カラムの収量が悪いだけであれば、PCRを10本でも100本でもやれば最終的には回収できるでしょう。 ただ、あまりに長さのおかしいものを除くために、はじめに1回電気泳動して、ゲルから欲しいサイズを切り出した方が、 後々に明らかに機能を持っていないだろうという小さいサイズのものが除けるので効率がいいと思います。

縮合プライマーを用いたPCR産物のクローニング 削除/引用 No.832-1 - 2009/07/09 (木) 13:44:30 - 縮合中 初めて投稿させていただきます。 現在、ある転写因子のカブにおけるホモログをクローニングするために実験を行っています。 他の植物ですでに配列が決定されているものから、縮合プライマーを設計し、二度のPCRを行いました。 得られた産物をアガロースゲル電気泳動で確認したところ、目的のホモログ遺伝子と考えられるバンドが複数検出され、これらをクローニングしようと考えています。 さて、ここからが問題点です。 通常ならゲルの切り出し精製を行う所なのですが、できるだけ多くの(コピー数が少なくバンドに検出されなかった配列もあるかもしれないので)配列を回収する狙いで、PCR産物をそのままカラム精製しました。 すると、溶出後のDNA溶液を5ul流しても、アガロース電気泳動ではPCR産物よりも少量のバンドが、しかも非常にうっすらとしか確認できなくなってしまいました。 やはり、PCR産物を精製し、全てのDNA断片をクローニング可能な量だけ回収することは不可能なのでしょうか。 検出されたバンド付近でゲルを切り出し精製することも考えていますが、もし複数のPCR産物を一度に精製できる方法をご存じの方がいらっしゃいましたらご教授や指摘を頂けないでしょうか。 PCRにはKOD FXを用い、商品添付プロトコル通りに50ulの系で反応を行いました。 カラム精製にはPromega社のWizard SV Gel PCR Clean-Up Systemを使用し、DNAの溶出は15ulで行いました。 長くなって申し訳ありませんが、よろしくお願いします。

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