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(無題) 削除/引用 No.879-10 - 2009/07/18 (土) 00:21:28 - GFP AcGFPの50番目の塩基の変異は蛍光特性には影響しない可能性の方が高いと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.879-9 - 2009/07/17 (金) 22:14:40 - m GFPに限らず、目的遺伝子に変異が入っていたら、その翻訳物は基本的には目的のものではないタンパク質と考えたほうがいいですよ。変異がかかっていてもアミノ酸の変異でなければ大丈夫ですが・・・

(無題) 削除/引用 No.879-8 - 2009/07/17 (金) 18:33:12 - う まず、常識として、PCRは酵素の種類にもよりますが，正確性に欠くことがあります。 正確性の高い酵素を使っても絶対ではありません。 変異はそのためと思います。それか誰かが既に変異したものを出回らせてそれを鋳型とした場合か。 なのでクローニングしたものをシーケンスして変異が入ったものは除外するのが常識かと思います。 ＞共焦点顕微鏡では蛍光が確認できるのに(退色が早いですが・・・)、フローサイトでは蛍光が感知されないということがあるので。 このことから、私は「そのGFPはそもそも光っていない」と推察します。 理由は １、確かにGFPは退色するが、顕微鏡で観察できないほど急速ではない ２、顕微鏡で見えているものがフローサイトで検出できないということはない 　　（フローサイトで検出できるが顕微鏡で見えないというのは検出感度の違いから経験ある） それで、質問者様のところで何が起こっているのかというと、自家蛍光を見ているのではないでしょうか？自家蛍光はすぐに消えることがあります。 はっきり申し上げて、こんなところで聞いてないで 担当教官、もしくは上司ときちんと状況を話し合われてください。

(無題) 削除/引用 No.879-7 - 2009/07/17 (金) 18:01:30 - R.O ＞＞通りすがりさん もう1度サブクローニングからやろうと思います。 この実験系は前任者の続きでして、前任者は発光が確認できたので続行したそうです。しかし、思うような結果が得られなかったわけですが。 >起こります。極端な話、活性中心を壊すような変異の場合、光らなくなります。 やはり、変異があるとまずいのですね。こちらももう一回やろうと思います。 具体的なPCRを行う際の対策は何かありませんか？ まだまだ初心者なもんで。。。 すみませんがよろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.879-6 - 2009/07/17 (金) 15:29:50 - 通りすがり >変異がなぜ入ったのか？ PCRの反応は大変低い頻度ですが、複製間違いを起こします。 使っているPCRの酵素によって、この間違いの頻度が違います。 fidelityを確認しましょう。 あと、シークエンスで変異が確認され、なおかつそれがナンセンス変異でない場合、そのまま次のステップに進まないでもう一度サブクローニングに戻ってやり直すのが普通です。 そこら辺、指導者とよく話し合っていますか？ >変異により退色は起きるのか？ 起こります。 極端な話、活性中心を壊すような変異の場合、光らなくなります。

(無題) 削除/引用 No.879-5 - 2009/07/17 (金) 15:19:11 - R.O ＞＞通りがかりさん ＞PCR のエラーでしょう。 　PCRのエラーということは、もう1度（もしくは何回も）行えば成功するかもしれないということですか？ ＞たとえば FLAG タグを３個組み込んだ GFP (3xFLAG-GFP) などは普通に使われています。 　FLAGタグを組み込むことによって、精製しやすくしているようですね。 　ほかにGFPなどの蛍光タンパクなどを複数つけることによって、蛍光が安定するという知見はありませんか？ペプチドを複数つけることも同様に、なにか知見は御知りではありませんか？ 　すみませんがよろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.879-4 - 2009/07/17 (金) 15:12:59 - R.O ＞＞うさん ＞変異が入った原因について、可能性をお尋ねですか？ それとも、変異がいはったことと退色の関係性をお聞きなのでしょうか？ 　変異がなぜ入ったのか？ 　変異により退色は起きるのか？ 　この2点が聞きたいことです。 　すみません、知っている範囲でご教授お願いします。 ＞＞例えばGFPを増やす場合、何を狙っているのか？ 例えばペプチドを増やす場合、何を狙っているのか？ 　GFPを増やすことで蛍光強度を上げたいと思っています。 　共焦点顕微鏡では蛍光が確認できるのに(退色が早いですが・・・)、フローサイトでは蛍光が感知されないということがあるので。 　ペプチド（細胞透過性）を増やすことについては、そのことに関する論文が読めてないので、くわしくは考えていません。。。 　GFPの蛍光が安定したり、細胞への導入効率が上がるといったことはあるのでしょうか？ 　以上よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.879-3 - 2009/07/17 (金) 12:08:59 - 通りがかり > こういった変異は一般に何が問題なのでしょうか？ PCR のエラーでしょう。 > こういったGFPもしくはペプチド(タンパク)配列を複数組み込むことは行われているのでしょうか？ たとえば FLAG タグを３個組み込んだ GFP (3xFLAG-GFP) などは普通に使われています。

(無題) 削除/引用 No.879-2 - 2009/07/17 (金) 11:25:02 - う １について ＞こういった変異は一般に何が問題なのでしょうか？ 結局何を聞きたいのかわかりません。 変異が入った原因について、可能性をお尋ねですか？ それとも、変異がいはったことと退色の関係性をお聞きなのでしょうか？ ２について ＞どちらかを増やしたいと考えています。 目的は？ 例えばGFPを増やす場合、何を狙っているのか？ 例えばペプチドを増やす場合、何を狙っているのか？ 「GFPとペプチドのどちらかを増やす」 GFPとペプチドが同じ立場で語られている意味がわかりません。 ＞そこで質問なのですが、こういったGFPもしくはペプチド(タンパク)配列を複数組み込むことは行われているのでしょうか？ 目的は？

GFP融合ペプチド　と　PCRの際の変異 削除/引用 No.879-1 - 2009/07/17 (金) 10:34:01 - R.O 　GFP融合ペプチドのベクターの作製および精製を行っています。 　 　pAcGFP1というベクターのGFP発現部位を切断し、そこにAcGFP-His6を組み込み精製しやすくしています。 　 　さらに、そのN末端もしくはC末端にペプチド配列を組み込むという2段階でベクターを作っています。 　�@しかし、ペプチドを組み込んだ後のシークエンスを確認した際に、AcGFPの50番目の塩基が変異してしまいました。その後、GFP融合ペプチドの精製を行いました、発光には問題がないのですが、細胞に投与した際に退色が早くうまく観察ができません。この変異が問題とは限らないのですが、こういった変異は一般に何が問題なのでしょうか？ 　�Aあと、GFP融合ペプチド(タンパク)について質問です。今はGFPとペプチドそれぞれ１つずつ組み込んでいるのですが、どちらかを増やしたいと考えています。たとえば、ペプチド配列を2つ組み込むなど。。。 　そこで質問なのですが、こういったGFPもしくはペプチド(タンパク)配列を複数組み込むことは行われているのでしょうか？ 　適切な論文が見つかればいいのですが。なかなか見つかりません・ 　以上、2つ、言葉足らずのところがあるかもしれませんが、ご教授お願いします。 　よろしくお願いします。

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