はじめまして、修士1年のいくと申します。サザンの件で質問があり、質問をさせてもらいます。回答おねがいします。
サザン（RI）＿実施プロトコル
@ゲノムDNA抽出
(1)tail0.5cm＋ProK＋Lysis Bufferを混合後、55℃o/n
(2)(1)のチューブにPCIを等量加え、voltex
(3)(2)のチューブを室温、14000rpm、5min遠心後、界面に気をつけsup回収
(4)(3)のsupにPCIを等量加え、voltex
(5)(3)と同様
(6)(5)のﾁｭｰﾌﾞに2倍量の100％EtOHを加え混和後、4℃,14000rpm,15min遠心
(7)(6)のﾁｭｰﾌﾞからsup除去し、70％etOHを1ml加え,4℃,14000rpm,15min遠心
(8)(7)のﾁｭｰﾌﾞからsup除去し、減圧遠心機で乾燥5min
(9)(8)のチューブに対し、25μlTEを加え、4℃でo/n
(10)(9)のサンプルをOD260測定し260/230の値が2以上、260/280の値が1.8〜1.9のものだけ選定した
A制限酵素処理
(TOYOBOの高濃度品EcoRI(50U/μl)、XbaI(40U/μl)を利用)
(1)@から得られたゲノムDNAを10μgオーダーで制限酵素処理した。
組成は以下のとおり。
ゲノムDNA→10μg 10xBuffer(H＆M)→10μl BSA→10μl enzyme→100U
滅菌水→適量 合計100μlの計で実施。
(2)37℃でo/n
B電気泳動〜ゲル前処理
(1)1％アガロースゲルで制限酵素処理が行われているか確認の電気泳動
(2)バンドがスメアになっているのを確認後、0.8％アガロースゲル(ラージサイズ)で電気泳動、30Vの低定電圧でo/nで電気泳動した。
(3)(2)のゲルをEtBr染色〜UV写真撮影
(4)(3)のゲルを0.25MHClでdepurination
(5)(4)のゲルを0.4ＭNaOH0/0.6ＭNaClでdenaturation
(6)(5)のゲルを0.5ＭTris-HCl(pH7.0)/1.0ＭNaClでneutralization
(7)(6)のゲルを20xSSCのブロッティング台にセットし、o/nでトランスファー(メンブレンには、GEヘルスケアのHybond-N+利用)
Cメンブレン処理
Bの処理が終わった後、メンブレンをゲルと分け、泳動開始地点にマーク処理後、2xSSCでwash、メンブレンの水気を切った後、80℃2hベイク処理。ベイク完了後、サランラップで包み4℃で保存。
Dプローブ標識
プローブの鋳型となるDNA断片(5'側→約400bp、3'側→約550bp)は、PCR法で増幅した産物をQIAGENのGel Extraction kitで精製後、100ngオーダーでプローブ用鋳型DNAとします。プローブ作製に用いたRIはα32P-dCTP、標識試薬にTakaRaのBca best labeling kit利用。
Eプレ〜ハイブリダイズ
プレハイブリダイゼーション液組成
チャーチリン酸バッファー(pH7.0) EDTA(500mM) SDS(10％) 滅菌水
秀潤社のサザンハイブリにおけるプレハイブリダイゼーション液の組成で行いました。液は65℃に温めます。
65℃,1hプレハイブリ後、2x10^6cpm/μlの比活性プローブを100μlいれ、65℃で16hハイブリダイズしました。なお、プレ〜ハイブリではうちにはメンブレンバックがないので、タッパーをもちい液量は100mlで行いました。
F洗い〜検出
(1)メンブレンをタッパーから取り出し、室温、2xSSC、15min洗い
(2)65℃,2xSSC/0.1％SDSで15min洗い
(3)65℃,1xSSC/0.1％SDSで10min洗い
(4)65℃,0.5xSSC/0.1％SDSで10min洗い
(5)65℃,0.1xSSC/0.1％SDSで5min洗い
(6)BAS-2500をもちいて検出
バンドの検出がうまくいきません。回答いただけますと助かります。
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