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(無題) 削除/引用 No.128-5 - 2009/03/20 (金) 00:30:34 - 打つ手なし yoさん、アドバイスどうもありがとうございます。 パパインはシグマの溶液になっているものを使用前に室温で30分活性化しております。 最近気付いたのですが溶液とは言っても白濁のコロイド状で濃度が一様ではなく、それが再現性の不味さにつながっているかもしれないということです。良く振って使うようにしたら溶け過ぎて細胞が死んでしまうということはなくなりました。 Worthingtonは皆さん良く使われているようなので、次に購入するときはこちらを試してみます。 最後に荒技ですが、溶け残った残骸をストレイナーの上から遠心管の底でゆっくり裏ごしにしてやると、意外と死なずに生き残る細胞が回収できることが分りました。マテメソにはあまり書きたくないやり方ですが…

(無題) 削除/引用 No.128-4 - 2009/03/19 (木) 19:21:56 - yo ルーチーンに海馬分散培養しています。 パパイン(Worthington)を愛用していますが、毎回再現よく処理できています。 そちらの詳しいプロトコルが不明ですが、パパインの活性化処理は一定にしておられますか？　解剖直前に溶解して37度で15分活性化した後、使用するまでon ice保存しています。 ピペッティングは、いわゆるブルーチップ(1mlのピペットマンのチップ)とイエローチップ(200ulのピペットマンのチップ)を順次用いることで毎回一定にすることが出来ます。

(無題) 削除/引用 No.128-3 - 2009/03/04 (水) 19:04:02 - 打つ手なし りょうさん、さっそくのご回答どうもありがとうございます。 全くおっしゃる通りで、トリプシンやパパインの消化が一番のボトルネックなので、他の条件を変えるのは止めた方が良さそうです。 消化後はピペッティングでバラしておりますが、火で焙ったピペットの先が毎回同じ口径にはならないので、そういうところも再現性に影響するのかもしれません。 トリプシンは共通のストックを使っていたのですが、ロットの差はあるかもしれませんね。 パパインの方が樹状突起の伸びが良かったのでできればこちらで固定したかったのですが、こちらは同じバイアルから使用してどうしてこれだけバラつきがあるものか、全く原因不明です。

(無題) 削除/引用 No.128-2 - 2009/03/03 (火) 23:49:52 - りょう あれこれと複数箇所を変えておられますが、最初の方の文章からすると、トリプシンでの消化時点で以前と違いがあるのですよね。 そこでの消化不良などによるロスで収量が減少したということで良いのでしょうか？ だとするとplating mediumやcoatingの部分をイジルのはどうかと思います。 根本的にEmbryonic day18でやるのが一般的かと思いますが、事情によりP0でされているとのことですから、溶けにくい(消化しにくい）のは想像できますが、以前は問題なかったことからすると、単にトリプシンのロットが悪い(or保存状態が悪い,または何らかの原因で劣化した）など「消化」の工程にだけ精査して、他は以前のmethodに全て戻すのが筋かと思います。 消化は静置しているだけでは完全に分散しないと思います。E18由来でも15-20min反応後、強めにpipettingして初めてsingle cellになると思います。 ちなみにトリプシンは昔のgibco(今はinvitrogenですかね）の粉末トリプシンをPBSで溶解していました。小分けして-20度以下の冷凍保存でした。 解剖・トリプシン処理はHBSS中でやっていました。

海馬分散培養で細胞の収率が悪い 削除/引用 No.128-1 - 2009/03/03 (火) 22:13:40 - 打つ手なし 海馬分散培養をルーチンでやってる者ですが、ここ半年くらい細胞の収率がどんどん低下しており、原因を突き止めることができずに困っております。 半年ほど前は生後すぐのマウス海馬をトリプシンで30分程溶かすだけで十分バラバラになって、十分な細胞数が得られてました。 しかしその後全く同じ方法で試して、溶けきれない組織がストレイナーに大量に引っかかるようになったため、酵素をトリプシンからパパイン(シグマ、20units/ml、45分)に切り替えて、条件を設定し直しました。これも最初は旨く行って収率が一旦は向上したのですが、酵素が効き過ぎて細胞が死んでしまったり、逆に溶け残ってストレイナーに引っかかったり、再現性が良くありません。再びトリプシンに戻したら以前よりはるかに溶け残りが多く、一体何が変わったのだろうと首を傾げているところです。 使っているマウスは同じストレーン、解剖は全て生後すぐ行っています。プレーティングにはDMEMかDMEM/F12に10％血清を加えたものを使っております。 コーティングのためのpoly-L-lysineを別のストックに変えたところだったので、水溶液になっているタイプのpoly-L-ornithineに変えたのですが、これもかえって逆効果のような印象を受けました。 ある事情があって胎児は使用することができません。生後すぐの海馬を再現性良く分散培養するコツをご存じの方がおられたら、ご教示頂けると助かります。

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