Bio Technical フォーラム

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ゲルの切り出し→エタ沈殿での作業について トピック削除
No.146-TOPIC - 2009/03/06 (金) 13:34:48 - ann
PCRでDNAを増やして電気泳動を行ったあと、QIAquick Spin キットでゲルから目的のDNAを抽出し、エタノール沈殿を行ってTE10μlに溶かしているのですが、最終濃度が0.05μg/μlと少ない濃度になってしまいます。
以前は一度同じように操作をして0.20μg/μlのDNAが得られました。前の実験と変えた所はPCRにおけるプライマーの変更ですが、電気泳動で単一のバンドが得られているので、PCRには問題がないと思います。ですが、プライマーを変えての最近2回の操作では0.05μg/μlとなってしまいます。エタノール沈殿での作業がまずいのでしょうか？また、この次に操作に制限酵素処理→ライゲーションと行うつもりなのですが、この濃度・DNA量でも大丈夫でしょうか？
　
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No.146-8 - 2009/03/11 (水) 16:31:43 - ann
解決しました。回答してくださったみなさんありがとうございます。

(無題) 削除/引用
No.146-7 - 2009/03/11 (水) 16:23:15 - ann
回答ありがとうございました。とても参考になりましたので次からの実験に役立てたいと思います。

(無題) 削除/引用
No.146-6 - 2009/03/06 (金) 18:20:08 - ann
バンドに関しては以前と同じようなので関係なさそうです。ってことはやはりQGの量でしょうか。以前は900ul加えたら大丈夫だったので、しっかりと不要なゲルを切り取るor　QGの量を増やしてみることで精製がうまくいきそうな感じですかね。

(無題) 削除/引用
No.146-5 - 2009/03/06 (金) 17:51:56 - ~
>前の実験と変えた所はPCRにおけるプライマーの変更
>今回使用したリバースプライマーがフォワードプライマーの半分しか加えていなかったことも収量が低くなった原因ですか？

１−１．プライマーが違うためにPCR産物量が減った
１−２．プライマーの濃度がアンバランスのためにPCR産物量が減った
２．PCR産物量は以前と同じだが、その後の精製でロスった(QG量不足など)
位が考えられる原因でしょうか。

PCR後に泳動していますよね。
前と今回のバンドの濃さの記録を見れば、1と２のどちらかは分かるでしょう。

次にPCRするときに、
A.以前のプライマー
B.今回のプライマー（モル比がアンバランス）
C.今回のプライマー（モル比を揃える）
をかけて、泳動してみればはっきりしますが、
実験が進められるはずですので、確認実験に時間を使うこともないと思います。

(無題) 削除/引用
No.146-4 - 2009/03/06 (金) 17:04:54 - ann
QGの量が怪しいですね。QGは900ul加えたのですが、ゲルを溶かすと1600ulぐらいになっていたので、足りていなかったと思います。

あとさきほどプライマーを確認しました。すると、同じ量のリバースプライマーとフォワードプライマーをPCRに用いたのですが、リバースプライマーの濃度が違っており、フォワードプライマーに対して半分の量しか加えていないことが判明しました。今回使用したリバースプライマーがフォワードプライマーの半分しか加えていなかったことも収量が低くなった原因ですか？

(無題) 削除/引用
No.146-3 - 2009/03/06 (金) 14:19:44 - りょう
〜さんが仰るように量的に問題ないでしょう。

4倍多めに欲しいならＰＣＲ反応を4本用意するかサイクル数２サイクル増やせば良いだけですよね。
前のプライマーを使用したものを横に並べて同様に収量が落ちているなら精製ステップの変化を疑っても良いでしょうが：研究者ならコントロールをたててください。

(無題) 削除/引用
No.146-2 - 2009/03/06 (金) 13:49:37 - ~
まず、50 ng/uLあれば、私ならば制限酵素で切ってサブクローニングする程度であれば次のステップに進みます。


気になるのは、
１．前回と比べてPCR収量に4倍の差が出ていないことは、確かめましたか？
　プライマーが変われば、4倍くらいの収量が変わってもおかしくはないでしょう
２．前回と同じボリュームですか？
　　前回は100uLで今回は20uLだったりしませんか？
３．QGの量をケチったりしていませんか？
　　十分なQGを入れないと、回収率が落ちるようです。
４．QG後に溶けていることは確認しましたか？色も見ましたか？
５．それ以降のQIAquick spinのプロトコルに忠実に従っていますか？
６．エタ沈を疑っているということは、あまり操作に自信がないということでしょうか？
　　エタチンメイトなどのキャリアを入れることもできますよ。

ゲルの切り出し→エタ沈殿での作業について 削除/引用
No.146-1 - 2009/03/06 (金) 13:34:48 - ann
PCRでDNAを増やして電気泳動を行ったあと、QIAquick Spin キットでゲルから目的のDNAを抽出し、エタノール沈殿を行ってTE10μlに溶かしているのですが、最終濃度が0.05μg/μlと少ない濃度になってしまいます。
以前は一度同じように操作をして0.20μg/μlのDNAが得られました。前の実験と変えた所はPCRにおけるプライマーの変更ですが、電気泳動で単一のバンドが得られているので、PCRには問題がないと思います。ですが、プライマーを変えての最近2回の操作では0.05μg/μlとなってしまいます。エタノール沈殿での作業がまずいのでしょうか？また、この次に操作に制限酵素処理→ライゲーションと行うつもりなのですが、この濃度・DNA量でも大丈夫でしょうか？
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