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タンパク質定量 トピック削除
No.151-TOPIC - 2009/03/07 (土) 13:16:17 - Western初心者
Westernをして、Tubulinのような内部コントロールが揃わず困っています。

細胞数を合わせてタンパク質を取っています。
細胞ペレットをPBSでsuspendし、SDSサンプルバッファ(Laemli)で
サンプルを作っています。
BioRADから販売されている、
還元剤、detergent存在下で測定可能とうたわれるキットで
タンパク質を定量しています。

ところがTubulinのパターンがまちまちです。
タンパク質定量が上手く行っていないように思います。
そもそもSDSサンプルバッファーで抽出してから定量を試みるというところに無理が有るのでしょうか?

また、核抽出液など、サンプルバッファーを加えない状態で、
タンパク質の凍結融解を繰り返しても、Westernには差し支えないのでしょうか?

ご教示いただければ幸いとぞんじます。
どうぞよろしくお願いいたします。
 
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7件 ( 1 〜 7 )  前 | 次  1/ 1. /1


ありがとうございます 削除/引用
No.151-7 - 2009/03/07 (土) 14:32:29 - Western初心者
名無しさん、
BPBと2-MEを後から加えることも新しいサンプルには試みてみようと思います。
ありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.151-6 - 2009/03/07 (土) 14:14:14 - 名無し
BCA法なら低濃度のSDSが存在しても蛋白質定量はできます。(還元剤は×)濃ければ必要量をとって水で適当に希釈して定量に供すればいいとおもいます。(例えば水45μlプラス5μlSDSサンプル+BCA、あとで定量値を10倍)細胞の溶解、蛋白質の抽出には還元剤とBPBを含まないサンプルバッファーを使います。還元剤とBPBは定量が終わってからサンプルに加えればいいです。

ご教示ありがとうございます 解決済み 削除/引用
No.151-5 - 2009/03/07 (土) 14:12:02 - Western初心者
〜さん、名無しさん、AKT48さん、
お忙しい中ご投稿くださりありがとうございました。

サンプル遠心、測定可能範囲、アプライ量など、見直し、再度おこなってみます。
また、凍結融解についても気をつけたいと思います。
大変勉強になりました。

(無題) 削除/引用
No.151-4 - 2009/03/07 (土) 13:59:58 - AKT48
先の方がおっしゃっているように、タンパク定量自体の妥当性がまず疑わしいです。実験内容がわからないのですが、Tubulin自体がそもそも変動しており、内部コントロールとしてふさわしくないのかもしれません。

あと別のご質問ですが、タンパクを扱う実験において凍結融解の繰り返しは、何においてもタブーと思います。

(無題) 削除/引用
No.151-3 - 2009/03/07 (土) 13:58:18 - 名無し
サンプルバッファーで細胞を溶かしてWBにもっていくのは昔から一般的によくおこなわれていますし、それ自体は問題ないように思います。ただこの方法ではDNAが解けて粘性が出てきますので、超音波あるいは細い針のシリンジでDNAをせん断してサラサラにする必要があります。またSDSでも完全に溶けない凝集物もわずかながらあることもよくあるので、その操作のあとに、1000-12000xgくらいで5−10分くらい遠心してそういうゴミを除きます(低温だとSDSが析出することがあるので、温度は15-20Cくらいがいい)。こうして得たきれいな蛋白質抽出液について蛋白質定量します。DNAの粘性があると正確なピペット操作が難しいですし、微細なゴミがあるような不均一な溶液でもまた正確な定量はできないので、一見瑣末なことのようですが、こうした処理は結構大切です。あと定量は一応デュプリケートでやるといいでしょう。また検量線の直線性のある範囲で測定できているかなども再度確認しましょう。ウェスタンではオーバーロディングすると、蛋白質が膜から脱落したり、シグナルが飽和して定量的な変化が見えなくなりますので、蛋白質のアプライ量も多すぎないように気をつけましょう。

凍結融解の繰り返しは細胞を壊す際に行われることがありますが、プロテアーゼの働く恐れはあると思います。もちろんクマシー染色でもわかるような明らかな分解はみえないと思いますが、個々の蛋白質についてみるとありえると思います。とりあえずプロテアーゼインヒビターは必要でしょう。

SDSならそういう問題はある程度回避できますが、SDS中で煮沸したサンプルでも保存中にゆっくりプロテアーゼが働くことはありえるのでけっして過信できません。-20Cに長くおいておくとWBではじめのころ見られなかった分解物が徐々に増えてきた経験があります。凍結融解繰り返すととくにそういうことがあります。SDSサンプルでも-80Cで保存して、かつ何回も使うなら小分けした方がいいです。

キット名を伏せられると、無駄な検索をしないといけなくなります 削除/引用
No.151-2 - 2009/03/07 (土) 13:36:10 - ~
キット名を言いたくないのでしたら、
BSAなどをLaemmliバッファーで希釈して測定して直線性をみれば、
測定できるかは分かると思いますが。

Bio-Rad社で還元剤、detergent存在下でOKということは、RCDCですよね。
http://pdbu-support.bio-rad.co.jp/answers/854.html

>そもそもSDSサンプルバッファーで抽出してから定量を試みるというところに無理が有るのでしょうか?
の答えになっていませんか?

タンパク質定量 削除/引用
No.151-1 - 2009/03/07 (土) 13:16:17 - Western初心者
Westernをして、Tubulinのような内部コントロールが揃わず困っています。

細胞数を合わせてタンパク質を取っています。
細胞ペレットをPBSでsuspendし、SDSサンプルバッファ(Laemli)で
サンプルを作っています。
BioRADから販売されている、
還元剤、detergent存在下で測定可能とうたわれるキットで
タンパク質を定量しています。

ところがTubulinのパターンがまちまちです。
タンパク質定量が上手く行っていないように思います。
そもそもSDSサンプルバッファーで抽出してから定量を試みるというところに無理が有るのでしょうか?

また、核抽出液など、サンプルバッファーを加えない状態で、
タンパク質の凍結融解を繰り返しても、Westernには差し支えないのでしょうか?

ご教示いただければ幸いとぞんじます。
どうぞよろしくお願いいたします。

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