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(無題) 削除/引用 No.17-4 - 2009/02/13 (金) 16:43:06 - yama １． http://www.origene.com/assets/Documents/catalog_manual/AppGuidecDNALibraries.pdf これを見るとoligo-dT XhoIでcDNAを作ってEcoRIのlinkerをライゲーションさせて作っているのでEcoRIもしくはXhoIのサイトのあるインサートは酵素カットが 十分でなかったためできたのでは？もしくはタンデムに繋がってしまった？ ２．余分なアミノ酸が増えてしまったためなにか問題が起きているのかもしれませんね。とりあえずタンパクの発現量等はたしかめましたか？ 簡単に同じ物を作りたければGap repairで作ることが可能だと思います。 後は、インサート中のEcoRIやXhoIサイトに（アミノ酸が変わらないように）変異を入れて切れないようにするとか？

(無題) 削除/引用 No.17-3 - 2009/02/13 (金) 15:50:29 - 中年 １）Y2Hに限らず、cDNAライブラリーに共通した問題ですよね。cDNAライブラリーの作製法を勉強されてはいかがですか。ライブラリー作製用のキットはいろいろな会社が出していますので、まずはそのマニュアルを読むのが良いと思います。 ２）ベクターを変えれば立体障害などの理由で擬陰性になる可能性はあります。もともとのベクターからpJG4-5へインサートを移し替えなくてはいけない理由があるのですか。

DuplexA systemを用いた酵母ツーハイブリッド 削除/引用 No.17-1 - 2009/02/12 (木) 12:34:55 - Ｊｕｎ DuplexA systemを用いてY2Hをおこなっています。 いくつかBaitタンパク質と相互作用するPreyタンパク質が得られたのですが、いくつか疑問に思ったことがあります。 �@Prey vectorのEcoRI/XhoI siteにインサートが挿入されているライブラリーを使用したのですが、得られたPreyプラスミドのインサートにはEcoRIもしくはXhoIのサイトが存在していました。そのため、再現性をみるために自分自身でpJG4-5 vectorへ当該インサートを挿入することができません。このライブラリーはどのように作製されたのでしょうか？ �A�@の問題を克服するために、EcoRI/XhoIサイト間に新たにいくつかの制限酵素サイトを付加しました。そこにスクリーニングで得られたPreyプラスミドにコードされていたcDNAを挿入し、再現性の確認をおこなったのですが、相互作用は検出されませんでした。普通に考えれば、スクリーニングで検出された相互作用は擬陽性という結論になると思います。しかしながら、別の実験から、スクリーニングで得られたPreyタンパク質はBaitタンパク質と相互作用することが示されています。よってpJG4-5 vectorへのMCSがBaitとPreyの相互作用の傷害になっているのではないかと感じています。 これらに対する知識をお持ちの方に原因や対策をお聞きしたいと思い、投稿させて頂きました。 よろしくおねがいします。

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