いつも参考にさせて頂いております。
以前にも似た質問がありましたが、私の場合とは状況が異なるようですので、新たにトピックをたてさせて頂きました。申し訳ありません。
私は現在、インビトロジェンのGatewayシステムを用い、ある遺伝子のRNAiコンストラクトを作成しております。
制限酵素を用いたクローニングにより、エントリーベクター(pENTR11を使用)の作成は終了し(シークエンスにより、正しい配列が挿入された事は確認)、LR反応を行いました。
使用した酵素、コンピテントセルは、それぞれGatewayLRクロナーゼ酵素ミックスとDH5αで、プロトコルは酵素に添付された説明書の通りです。ただし、LR反応の時間を60分から6時間と長めに変更しました。これは、用いたデスティネーションベクターがpRISEというRNAi作成用のベクター(逆向きの反復配列ができるよう、Gatewayカセットが逆向きで二箇所存在)で、組換えを二回起こす必要があったからです。
Ampプレートで培養したところ、数十個のコロニーが得られました。幾つかのコロニーをピックアップし、ミニプレップ後、制限酵素XhoTでカットチェックを行ってみました。計画では、XhoTカットにより、約10000bpのバンドが一本見られるはずだったのですが、正しくない位置(約6000bp、約4000bpの2パターンありました)にバンドが一本見られるのみです。これは一体何を意味しているのでしょうか？ご存知の方はいらっしゃいませんか？
もしも同じような事象を経験したことが有る方は、ご意見またはアドバイスや解決方法を示していただければ、非常にありがたいです。よろしくお願いいたします。 |
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