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(無題) 削除/引用 No.183-8 - 2009/03/16 (月) 12:57:48 - RT-PCR初心者 現在、死菌体とご指摘の、死んではいないがコロニーを形成しない菌体（我われの場合、主として栄養菌体）の両方について実験的検証を進めるところです。これが数値のブレを引き起こしているのではないかと思っています。また、細胞中での存在比は分子量はちがうものの約DNA：RNA=1:3000とのこと。ですからRNA→cDNAをPCRのテンプレートにすれば感度が上がります。昨年一年間実験的検討した中では、やはりgenomic DNAだけでは感度が低く、先にお話した定性RT-PCRは確立できませんでした・・・。

(無題) 削除/引用 No.183-7 - 2009/03/16 (月) 12:40:24 - ザンギ ご教授ありがとうございます。 面白いですね。 コピー数が厳密に制御されてるRNA分子があるんですね。 ただ、ゲノムPCRがRT-PCRに感度で劣るという点はちょっと理解が難しいです。 厳密に1細胞1転写産物以上のRNAであれば、逆転写反応のステップがないぶんだけゲノムPCRのほうが感度が良さそうです。 一般論としてDNAのほうが物質として安定なので死菌からのコンタミが多くて、菌体数の計測には不適ということは想像しやすいと思います。 プレートでコロニーカウントによる生菌数の計数とのことですが、死んではいないけど増えもしない菌のポピュレーションは問題にならないのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.183-6 - 2009/03/16 (月) 10:55:18 - RT-PCR初心者 返信ありがとうございます。 我われは、RNAを対象としています。RNA→cDNAをテンプレートとしております。RNAがだめなら、genomic DNAでやってみようか・・・とも考えております。ただ、今までの経験からすれば、検出感度は稼げないでしょう。 なかなか上手くいかないものです。

(無題) 削除/引用 No.183-5 - 2009/03/16 (月) 10:45:29 - Pumpkin なるほど、そのような試みがあるのですね。ただよく分からないのは、mRNAが1コピーだとか10コピーだとか常にどの時期でもその数だけ発現しているなどということは前提にならないような気がするのですが、どうなんでしょうか。 要はブレ幅が凄すぎて見られないんじゃないかというような気がするんです。 あ、もしかしてRNAがターゲットじゃなくてgDNAを定量PCRしているのであって、誤差が大きいのはRNAが邪魔しているんじゃないかってことですか？例えば、栄研とかのLAMP法とかかな。 とはいえ、専門でないので暇なときに論文でも読んでみます。

(無題) 削除/引用 No.183-4 - 2009/03/16 (月) 10:08:23 - RT-PCR初心者 皆様 情報ありがとうございます。 ただ、QRT−PCRを使って未知試料中の菌数を推定する試みは多数されており、文献も見受けられます。学会発表でも約10年ほど前より発表が多数あります。ただ、実用に生かされているものはあまりないように思われます。 我われも、定性でのRT-PCR法を確立したので、定量への展開を試みているというのが経緯です。 ある会社では我われと同じターゲットの種のなかで、特定の株については研究の中で実用化をしているようです。これは1cell=1copyであることがはっきりしているからです。研究で使用する1株のみに限定してしまえば容易なのかもしれませんが、我われはコピー数未知株の菌数を推定しようとするものなので、はじめから容易ではないことを推定しておりました。でも1cell=10copy・・などという株も文献からすれば、また極めて少ないわけで、RT-PCRの推定菌数のずれは1logにまで違わずに可能ではないかと考えました。 皆さんのご指摘からすればやはり難しい話なのですね。 アプライドバイオシステムズ社の専門家にも聞いてみましたが、彼らの見解は我われと同じで、死菌体などのRNAが影響しているのではないか？とのことでした。 いずれにしましても、これを解決するのはそうそう容易ではないことがわかりました。皆さんのご指摘・アドバイスありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.183-3 - 2009/03/15 (日) 20:07:49 - Pumpkin 私もザンギさんのお答えが全てのように思えます。 あくまで、どのようなもの由来であろうとRNAはRNAという化学物質でしかありませんのでソースによる分別分解などということはできません。しかしながら、芽胞特異的または栄養特異的なmRNAあればそれぞれを検出可能ですが、それも菌量を反映することはないため区別は無理です。 QPCRは転写産物を定量的に違いをみようとしているのであって、菌体数の定量をするものではありませんが、トピ主さんはこのようなことをお考えなのでしょうか。それとも、こちらが意図を汲めていませんか？

(無題) 削除/引用 No.183-2 - 2009/03/14 (土) 03:07:51 - ザンギ すいません。素人なので教えてください。 一般論として細胞内のＲＮＡの量は分子種にかかわらず一定ではないので、菌体数を反映するとは期待できません。 この属の菌で、菌対数を測定するのに定量ＲＴ−ＰＣＲは確立された方法論なのでしょうか？ 芽胞特異的な転写産物を測定してるということでしょうか。 死菌ではＲＮＡは速やかに分解されると思われるので、ＰＣＲの鋳型になるようなＲＮＡは持ってないと思います。 精製してしまったＲＮＡから栄養菌体由来のＲＮＡだけを分解する方法はないでしょうね。 問題になりそうなのは、栄養菌体でのＲＮＡの転写レベルとＲＮＡの抽出効率ではないかと思われますが、いかがでしょう。 栄養菌体だけを殺せる方法があればいいんですが、変に誘導をかけてしまったら測定になりませんね。

RT-PCRへの死菌・栄養菌体RNAの影響 削除/引用 No.183-1 - 2009/03/13 (金) 16:31:01 - RT-PCR初心者 現在、Bacillus属近縁芽胞菌の定量RT-PCRを検討しています。しかし、検量線から算出した生菌数推定値が実測値（通常のプレートカウント）と大幅にことなる現象が認められています。同じ菌種でも株レベルでその差異はことなります。長年の経験上、芽胞菌の生菌数は栄養菌体数との相関は低く、芽胞数との相関が高いと認識しています。従いまして、QRT-PCRと実際の生菌数値との差異は、栄養菌体や死菌体のRNAが原因ではないかと推定しています。 となれば、QRT-PCRと生菌数実測値の誤差を小さくするためには、芽胞以外の栄養菌体・死菌体のRNAを除去する処理（短時間のRNase??)が有効ではないかと考えているのですが、いかがなものでしょうか？良い前処理法をご存知であればご教示いただきたくよろしくお願いします。

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