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(無題) 削除/引用 No.184-6 - 2009/03/15 (日) 20:48:00 - A 既に実験されて遅いかもしれませんが。 封入体中のタンパク質ですが私のところでは変性条件でNi-NTAを 使ってイミダゾールで溶出しています。バッファーはPBSpH7.4です。 イミダゾールを入れるとpHが変わってしまうので溶出バッファーは イミダゾールを入れた後にpHを7.4に調整しなおしています。 精製タンパク質はこの後希釈法でリフォールドしています。

(無題) 削除/引用 No.184-5 - 2009/03/14 (土) 16:38:40 - いちろう ご指摘の点ですが、Qiagenの変性条件下のプロトコールでは、溶出はUreaを用いてｐＨを徐々に下げて溶出させる方法が書かれているので、その通りにしています。以前Qiagenのテクニカルサポートの方に、変性条件下の精製でQiagenのNi-NTAを用いて、ｐＨを下げずに、イミダゾールを用いて溶出させることも可能なのか聞いたところ、Qiagenにはそういった資料がないからわからないと言われ、Qiagenのプロトコール通りの溶出法を行っていました。非変性条件下のプロトコールではｐＨでなくイミダゾールで溶出させてあるので、なぜ変性条件下と非変性条件下で溶出法が違うのか不思議だったのですが。。。 　変性条件下の精製でQiagenのNi-NTAを用いて、イミダゾールでうまく溶出できたご経験のある方はいらっしゃいますでしょうか？ 　ご指摘の通り、ｐＨを変えずイミダゾールで溶出させてみます。

(無題) 削除/引用 No.184-4 - 2009/03/14 (土) 06:47:27 - C 溶出液のpHを4.5にする特別な理由があるのでしょうか。それともpH4.5だったということでしょうか。イミダゾールとグアニジン塩酸を含むpH8.0のbufferで溶出すればいいだけの話ではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.184-3 - 2009/03/13 (金) 23:54:27 - いちろう 20倍希釈を予定しています。

(無題) 削除/引用 No.184-2 - 2009/03/13 (金) 22:35:13 - A 希釈率によるでしょうね。たとえば１００倍あれば気にしなくても良いと思います。予定されている希釈率はどれほどですか？

His tag タンパクの精製後のrefolding方法について 削除/引用 No.184-1 - 2009/03/13 (金) 16:42:07 - いちろう His tag タンパクの精製を行っています。QiagenのNi-NTAを用いてグアニジン での変性条件下でバッチ法で精製した後、Ureaによる溶出液をrefoldingするところなのですが、ここで質問があります。 　refoldingは希釈法でpH8.0のrefolding bufferで行いたいのですが、バッチの溶出液のpHは4.5で大幅に異なります。 このような場合そのままpH4.5の溶出液をpH8.0のrefolding bufferで希釈するのは不可能なものなのでしょうか？その後の透析などの過程を考えると、できればpH８で進めていきたいのですが、pH4.5の溶出液をNaOHをもちいてpH8に合わせてから、refoldingをはじめるものなのでしょうか？ 　段階透析法を用いる場合もスタートのｐＨが８の場合が多いと思うのですが、 変性タンパクのｐＨが4.5の時はどうやって始めるものなのでしょうか？ 　refolding操作は初心者なため、くわしく教えていただけますでしょうか？ Ni-NTAでの精製後のrefolding（希釈法or段階透析）についてプロトコールを教えていただければ助かります。

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