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ご意見ありがとうございます 削除/引用 No.214-5 - 2009/03/20 (金) 23:41:08 - Vivo屋 "通りがかり"さん、貴重なご意見ありがとうございます。 おっしゃるとおり、根本的にDNAfragmentを比較する実験で、タンパク濃度をそろえる意味がそもそもあるか疑問です。何をもって「科学的に平等な状態である」と評価できるのか。仮にタンパクをそろえることを目標として、以前単純にBufferを希釈してみたのですが、１０００倍まで希釈してやっと使える状況になりました。問題の一つは、私の使用しているサンプルが微量しか採取できないことにあります。１０００倍まで薄めてしまうと、検出範囲の濃度を下回ってしまうか、もしくは検出範囲に持って行くために非常にたくさんのサンプルを必要としてしまいます。 もう一度じっくり考えてみます。失礼します。

(無題) 削除/引用 No.214-4 - 2009/03/20 (金) 11:14:11 - 通りがかり タンパク量でそろえる必要があるのでしょうか？ cell death が盛大に起きている組織とそうでない組織では細胞当たりのタンパク量も変わってきそうですが。 組織の湿重量でそろえたのではダメなのですか？ cell death が起きてもタンパクには大きな変化はないと仮定するなら、SDS-PAGE を流して CBB で染めるとか、アクチンなどの適当なコントロール蛋白のウェスタンを行うとかすれば、ある程度補正はできると思います。 あるいは単に何倍かに希釈してから濃度を測定するとか。

そうなんです 削除/引用 No.214-3 - 2009/03/20 (金) 07:28:32 - Vivo屋 TSさん、ご意見ありがとうございます。 Lysis Bufferと一言で言っている時点で甘いんですよね。おっしゃるとおりです。問題は今回の目的がELISAといってもタンパクでなく（死んで行く？）DNA-fragmentであることだと感じています。Bufferの組成もいまいちはっきり教えてもらえないですし。タンパク相手ならBufferもいい条件のものを探せるかな？と思うのですが、如何せんApoptotic cellの知識が全くなく困っています。ご教示いただければ幸いです。皆様宜しくお願いいたします。

だめでしょ。 削除/引用 No.214-2 - 2009/03/20 (金) 01:24:43 - TS 率直に感じたことですが、 BCAで測定できないようなサンプルがELISAで抗体にくっつくんですか？ いずれにしても、BCAも含めて、どのキットも許容できる（測定に影響しない）Detergent、塩などの濃度が一覧になっているはずですので、それ以下になるようなLysisバッファーを使うか、それ以下に希釈してから測定すれば良いのではないですか？ Lysisバッファーとかって一言で言ってる時点で、バッファー組成をご自分で考えてないんだなって思いましたけど、どうですか？ もう少し自分で勉強した方がよいと思います。

Lysis Buffer中のタンパク濃度測定 削除/引用 No.214-1 - 2009/03/20 (金) 01:07:01 - Vivo屋 いつもレベルの高いディスカッションを拝見し勉強させて頂いております。今回、Lysis Buffer中のタンパク濃度の測定方法について質問させて頂きます。 組織中のApotosisの程度を比較する目的でRocheのCell Death Detection ELISAを購入してみました。Instructionには培養細胞を用いた実験手順が記載されていました。小生の使用サンプルは培養細胞ではなく、マウスの組織をLysis Bufferに溶解したものです。計画では各サンプルのタンパク濃度をそろえて、ELISAを測定するつもりでした。通常タンパク濃度を測定する際には、BioRadのProtein Assay ReagentやPierceのBCA Protein Assay Reagent Kitを使用しますが、この両者では正確な濃度が測れませんでした。Rocheに伺ったところ、Buffer中の塩などの都合でタンパク濃度は測れないとの回答でした。 こういう状況で、他にタンパク濃度をそろえる方法はあるでしょうか？何か良い策がありましたらご教示願いたいと思います。何卒宜しくお願いいたします。

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