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(無題) 削除/引用 No.215-5 - 2009/03/22 (日) 08:51:00 - あなたにノックアウトされて Tbさん、ありがとうございます。 目的はTbさんがお書きになったとうりです。 現在標的遺伝子+3'UTR+polyAがはいっているexpression vectorをもっているので、 簡単にスクリーニング用のコンストラクトを作ろうと思った次第です。

大丈夫だと思います 削除/引用 No.215-4 - 2009/03/21 (土) 06:33:41 - Tb 作成したRNAi配列がちゃんとワークするものであることを本試験の前にトランスフェクションが楽な培養細胞とかを使って証明しておきたいということですよね？ 私はいくつかの遺伝子で、ベストのshRNA発現ウイルスベクターを見つけるのに似たようなアプローチをしたことがあります。それは、目的遺伝子 - IRES - GFPをレトロで入れた細胞を用意し（というか持っていたので）、これに目的遺伝子に対するshRNA発現レトロ（あるいはレンチ）ウイルスを感染させてGFPの強度の低下で評価するというものでした。GFP配列を先頭に持ってくるトピ主さんの方法でも大丈夫でしょう。

(無題) 削除/引用 No.215-3 - 2009/03/20 (金) 23:05:11 - あなたにノックアウトされて タンパクレベルで標的分子、もしくはGFP-標的分子fuision のknock downをみることを目的としているのではありません。 GFPにストップコドンがついていても、 transcription termination signalがなければそのままGFP-標的遺伝子のmRNAは 転写されますよね。 そうすると、 標的分子へのRNAi効果なし->GFPタンパク発現 標的分子へのRNAi効果あり-> GFPタンパク低下 というわけで、標的遺伝子に対するRNAi効果はGFP発現(タンパク)でみられると思ったのですが。

(無題) 削除/引用 No.215-2 - 2009/03/20 (金) 20:42:47 - NE ・・・・ １、mRNAレベルで標的遺伝子へのRNAi効果を見るなら問題ないかも。 ２、タンパクレベルでGFPのノックダウンを見るなら問題ないでしょう。 ３、タンパクレベルで標的遺伝子へのRNAi効果を見るなら・・・・。 基本的なことですので、先輩に尋ねましょう。。。

RNAi効果検証 削除/引用 No.215-1 - 2009/03/20 (金) 13:34:28 - あなたにノックアウトされて RNAi効果検証のため、GFPの下流に標的遺伝子をつなげた expression vectorを作ろうと考えています。 GFPはstopコドンをつけたままでも、RNAi効果検証に問題ないと 考える次第ですが、私合ってますでしょうか。 もしくはきちんとGFP-標的分子融合タンパクができるコンストラクトの方がよいのでしょうか。

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