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(無題) 削除/引用 No.219-9 - 2009/03/30 (月) 19:45:59 - RS１１１ jazzmessengerさま お返事ありがとうございます。 大変参考になりました。 ミスマッチプライマーは設計領域が限られるので 理想的なプライマーを設計するのに四苦八苦しますね。

プライマー設計 削除/引用 No.219-8 - 2009/03/26 (木) 01:54:40 - jazzmessenger >[Re:5] RS１１１さんは書きました : > 追加で質問させて頂きます。 > > > ミスマッチプライマーと対となるプライマーの設計は > どのようにされているでしょうか。 > > ミスマッチプライマーの場所から、上流または下流200bpあたりの > 配列を適当に選び、amplifyなどでチェックされているのでしょうか。 私はPrimer3を使用していますが、他のプログラムでも問題ないでしょう。ミスマッチが入るプライマーはSNPの直前のシークエンスですよね。そこから20-30塩基程度で60度(または自分の使いたいTm)でプライマーをデザインします。それと合うプライマーを上流または下流200-500bpあたりで適当に探すだけです。ミスマッチを入れたシークエンスを使用してください。 ミスマッチプライマーのTmが高すぎたり、低すぎたりする場合は60度になるように長さを調節します。あと、ミスマッチがあると実際よりTmが低いので(最初だけですが)、ペアになるプライマーよりTmを若干あげたりもしています。 ミスマッチプライマーが短かかったり、RFLP後のプロダクトが短いと、Alleleの差を電気泳動で確認するのが難しいですよね。そういった時は10bpランダムシークエンスを両プライマーの5'末に付けたりします。ランダムといいつつ、私はいつも同じシークエンスを追加していますが。

(無題) 削除/引用 No.219-7 - 2009/03/26 (木) 01:29:19 - jazzmessenger >[Re:4] RS１１１さんは書きました : > jazzmessenger 様 > > > 有益な情報ありがとうございます。 > > 文献など読むと変異の数が少ない方がよいなど > 書いてあるので2個以内に抑えようと考えています。 > > これまで経験がないので教えて頂きたいのですが、 > 2個でも連続して変異を入れるのとひとつおいて > 入れるのではPCRの難しさに違いが生じますか？ 2個連続だとPCRのかかりは多少悪くなると思います。プライマーの3'末から変異がどれだけ離れているかが大事になってきます。正常な塩基が3'末に2個以上あれば問題ないと思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.219-6 - 2009/03/25 (水) 20:44:39 - カナマイシン あれ？　おかしいな… 書き込みをした瞬間には繋がってました （自分でリンクも踏んで確かめました）。 親ページのhttp://www.dwalab.com/ ですら繋がらなくなっているので、 メンテナンスか何かで落ちているのかも？

(無題) 削除/引用 No.219-5 - 2009/03/25 (水) 19:10:32 - RS１１１ 追加で質問させて頂きます。 ミスマッチプライマーと対となるプライマーの設計は どのようにされているでしょうか。 ミスマッチプライマーの場所から、上流または下流200bpあたりの 配列を適当に選び、amplifyなどでチェックされているのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.219-4 - 2009/03/25 (水) 17:46:48 - RS１１１ jazzmessenger 様 有益な情報ありがとうございます。 文献など読むと変異の数が少ない方がよいなど 書いてあるので2個以内に抑えようと考えています。 これまで経験がないので教えて頂きたいのですが、 2個でも連続して変異を入れるのとひとつおいて 入れるのではPCRの難しさに違いが生じますか？ カナマイシン様 残念ながら、リンクしないです、、、。 閉鎖したのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.219-3 - 2009/03/25 (水) 00:25:54 - カナマイシン 以前ここで教えていただいたものですが、Silent Sites ↓ とてもいいですよ。 対象DNA領域をコピペして、進んでいくだけです。 http://www.dwalab.com/DNAProject/bin/DNA_Analysis_Frame.html

Webcutter 削除/引用 No.219-2 - 2009/03/24 (火) 21:37:58 - jazzmessenger 私はWebcutter(http://rna.lundberg.gu.se/cgi-bin/cutter2/cutter)を利用しています。まず、Alleleの違う二つのシークエンスを用意します。両サイド10塩基程度。それから2-5離れた塩基を次々Nに変えて、どちらかのAlleleだけ切れる酵素を探します。主な酵素は6bpカッターまでですので、SNPプラス2-5塩基ということです。当然、SNPに近ければ近い程、SNPを切れる酵素は増えますが、ミスマッチは3′末から離れた方がPCR効率は上がります。できるだけSNPから離れたところにミスマッチを入れますが、大抵2か3塩基目にミスマッチに落ち着きます。SNPから1塩基目(3′末にミスマッチ)はPCRの効率上避けた方が無難です。

ミスマッチプライマーによる制限酵素サイトの導入 削除/引用 No.219-1 - 2009/03/23 (月) 12:37:47 - RS１１１ SNP解析のため、制限酵素サイトでないある遺伝子の領域に ミスマッチプライマーを用いて制限酵素サイトを作りたいと考えています。 その際、どこに変異を入れれば制限酵素サイトになるか調べてくれる 便利なサイトなどないのでしょうか？

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