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Re4: 削除/引用 No.228-22 - 2009/03/31 (火) 17:49:34 - あさひ ＞しまさま、 お返事ありがとうございます。 はい、一応ラットの解剖図（マウスのは見つからず）で確認して、同僚にもどれが大動脈か示してもらっています。 静脈が赤黒く目立つのに対し、色的に見分けが付きづらかったのと静脈よりだいぶ細いこと（これから採血をされている？）、そして、しまさまがおっしゃるほど膜を指で除いただけでは余計な組織がとれずにいるので･･･時間も5分というわけには･･･ などと、皆様ほどのレベルにまだまだ達していないため、色々不安で初歩的な質問をしてしまいました。わざわざご解答していただきありがとうございました。 おそらく後は手技の問題かと思います。 今まで何度となくご指導いただきありがとうございました。 一まず解決ということで、皆様お世話になりました。

(無題) 削除/引用 No.228-21 - 2009/03/30 (月) 18:45:37 - しま 腹部では動脈と静脈は近接並行しています。 動脈はほとんどの場合右にあります。 極たまーに奇形で反対側にあるものもあります。 一度、マウスの解剖アトラスなどで、 きちんと確認してみることをお勧めします。 基礎知識が無いまま、文章だけで説明しても 間違った部位を採取してしまう恐れがあります。 ちゃんとした知識があって解剖すれば 血管と他の組織を間違うことなんてありませんし、 動脈と静脈の違いは一目瞭然です。

Re3: 削除/引用 No.228-20 - 2009/03/28 (土) 18:49:12 - あさひ >Pumpkinさま、 RNAlaterレシピ、ありがとうございます。とても簡単に作れるんですね。確かにこれを買うのはもったいない。 ＞ボス飼殺しさま、 はい、今まで練習で大動脈を回収していますので、たんぱく抽出してみようと思います。また、これからは弓部とかに絞っても集めてこようかなと思いますが、マウスの大動脈、本当に少ないですよね…。ありがたいことに設備的にはin situもReal time-RT-PCRも何でもできるのです。ただただマウスの大動脈はサンプルが少ない…これが今一番の悩みです。 【腹部大動脈の見つけ方】 ついでにどなたか教えて頂きたく、ここに書かせて頂きます。私は下大静脈（腎臓にいくために二股に分かれる手前の所から分かれた所あたり）から採血しているのですが、中には大動脈から採血されている方もおられますよね。それは腹部大動脈なのでしょうか？探してみると下大静脈の右手側に1/3くらいの細さの血管？が見えて、ん？これが大動脈かなと思ったりしたのですが、そこから採血されているのでしょうか？ 何とか大動脈は腹部も取ってこれるようになりましたが、まだしまさまのおっしゃるほどきれいにはとれて来れません。まだまだ練習が必要のようです。

(無題) 削除/引用 No.228-19 - 2009/03/28 (土) 05:19:03 - CJ Pumpkinさま RNAlaterの作成法を教えていただき、ありがとうございます。 作れるとは知りませんでした…。こんな簡単な試薬で作れるとなるとあの価格はぼったくりといった感じですね…。

マウス大動脈の採取部位と組織量 削除/引用 No.228-18 - 2009/03/27 (金) 16:40:45 - ボス飼殺し 大動脈の採取部分についてですが、アテロームを ターゲットにするなら、好発部位の大動脈弓を中心に するべきかなぁ？と思います。 ただ、あさひさんの問題はサンプルのボリューム (タンパク、RNA量)ということになるので、 不足気味なら横隔膜より上の胸部大動脈まで入れる ということが妥協点かもしれませんね。 いずれにしても、まずは予備的な実験で、どれくらいの 採取部位(組織量)で目的のmRNAやタンパクが検出できるのか？ を検討した方が、今後のためにもいいと思いますが、 いかがでしょうか？ ボスや指導的立場の方々と相談してみてください。 解析についてはmRNAなら、Real time PCRだと 少量のサンプルでも測定でき、この分野では 比較的受け入れられている解析方法だと思います。 ただ、設備や経験(ノウハウ)の問題があるかもしれませんね。 タンパクについては、比較的量のあるものなら、 大動脈弓サンプルだけでもバンドが出るかもしれません。 元々量が少ないタンパクの場合は、複数個体の サンプルをプールして1レーンに流すということに なるのではないでしょうか？ あと、定量性はずっと落ちますが、組織切片を作って 免染、in situの陽性シグナル(面積や密度、細胞数など)を 計測する半定量的な方法もあります。この分野の雑誌･論文は、 結構この方法を利用しています。 (名前長過ぎるので省略しました)

(無題) 削除/引用 No.228-17 - 2009/03/27 (金) 11:41:26 - Pumpkin 下記リンクのレシピでいいと思います。ポイントなんかも書いてあるので、参考にされたらいいと思います。 //www.biocenter.helsinki.fi/bi/bare-1_html/RNAlater.html

みなさまへ、 削除/引用 No.228-16 - 2009/03/27 (金) 10:54:09 - あさひ みなさま、お返事ありがとうございます。 ＞CJさま、Pumpkinさま、 ボスに殺される？！それは金銭的理由からでしょうか？RNAlater安価に自作できるのですね。知りませんでした。以前このフォーラムでも話題になったようでしたが、そこにあったリンクがすでに無効になっており詳しい組成は探し出せませんでした。 だれかご存知でしたらご教授ください。 ＞俺はもうボスに飼い殺されているさま、 むむむ。それは困りました･･･。それにしても、皆様はどうやって十分量のサンプルを回収してきているのでしょうか？マウスの大動脈はわずかなもので、さらにそこから弓部のアテロームのみにピンポイントを当てるとか･･･in situでRNA染色するならできるかなと思いますが･･･私が読んだいくつかの論文では、PCRとかWBのサンプルがAortaとしか記載されてなかったのですが、俺はもうボスに飼い殺されているさまのように、されている方はきちんと部位を選んでされているのでしょうね。筋層と粘膜層をわけるのも大変だな、ミックスしたままにしようかと考えていたので、また考え直さないといけませんね。（ちなみに今回はサンプル量が少ないのでRNAは諦めタンパクのみにしました･･･） ＞しまさま、 昨日4匹練習してみました。採血してしまうと腹部の血管は二股にわかれているところを見つけるのがやっとで、それも静脈だと思っているのですが…あれは動脈なのでしょうか？初めの2匹は腹部からトライしましたが、血管がよくわからず、筋線維や結合組織だと思っていたものが血管だったのか途中でピンセットで切ってしまいました。あとの2匹は胸部をまずトリミングし、横隔膜のところの組織を除き、そのまましたにトリミングしてきました。胸部の結合組織はピンセットでつまむとピリリとはがれる感じに取れました。腹部は周りの筋肉を横に寄せて溝を作る感じでよけていきました。 しまさまの教えてくださったように、キムタオルなどを使ってまた練習してみますね。

(無題) 削除/引用 No.228-15 - 2009/03/27 (金) 09:44:44 - しま 採血の時についでに取れる腹大動脈を採取しています。 開腹して消化器を右側に除け、血管が見えたら 血管の両脇にキムワイプか乾綿をあてがって 親指で押し広げるようにすると、血管を覆っている 脂肪組織などが裂けて、血管が露出します。 この時点で腹側の結合組織はほとんど取れてます。 後はピンセット二本を上手に使って血管を剥離してください。 一方のピンセットで血管を持ち上げたら血管と結合組織の 境界をピンセットの先端で刺すようにして分離します。 言葉で説明するのは難しいですね。 解剖の上手な人に見せてもらうのが一番だと思います。

大動脈のアテローム 削除/引用 No.228-14 - 2009/03/27 (金) 00:35:43 - 俺はもうボスに飼い殺されている 若干、本トピから外れて、また少々難しい話で恐縮ですが… 以前にとある学会(研究会)で、ある大学の病理の先生が ｢同じ大動脈といっても場所によって、例えば胸部と腹部によって 発現因子やアテロームのタイプ(たぶん細胞や組織の構成)が違う｣ というようなことを、質問で発言されていた記憶があります。 私自身も、動脈硬化関係(血管)の解剖･組織屋の端くれなのですが、 確かに場所によって動脈硬化巣の組織構造が違うように思います。 例えば大動脈弓部と腎動脈分岐部や、同じ大動脈弓部でも 腕頭動脈の分岐部は少し違うみたいな… (具体的なことは研究のネタバレになりかねないので、ごめんなさい) なので、同じ大動脈を丸ごと一本のサンプルとして解析に使うのは、 後々論文として投稿した時に、厳しいレフェリーに突っ込まれる 弱点になるかもしれません。 まぁ、飼い殺されキャラの独り言なので、あまり気にしないで下さい… あと、剥がした外膜は大切に取っておくと後々良いことが… あぁ、これ以上は言えません。

(無題) 削除/引用 No.228-13 - 2009/03/26 (木) 22:51:04 - Pumpkin 以前のトピにありますが、RNAlaterを自作すれば、ボスに殺されないですみそうです。

(無題) 削除/引用 No.228-12 - 2009/03/26 (木) 22:37:29 - CJ RNAlaterで潅流すればすごく良いのは間違いないしょうが（フローサイトメトリー用の細胞の固定でアルコール固定よりもアルコール＋RNAlater混合液固定のほうがＲＮＡの保存が良い、という技術報告をみたことがあります）、たぶんラボのボスに殺されると思いますよ。

Re2: 削除/引用 No.228-11 - 2009/03/26 (木) 10:16:52 - あさひ >CJさま、 お返事ありがとうございます。 はい、灌流固定はしたことあります。アルコールで固定してRNAの抽出（やタンパク採取）できたら安上がりでいいのですが、私の技量だと不安かなとも思います。本試験は2ヵ月後なので、それまでにできるだけ練習して、無理そうだったらRNAlaterを購入してそれで灌流しようかなと思っています。 ＞しまさま、 お返事ありがとうございます。 そうですね、うちのラボでは100mg組織/1mlTrizolでRNA抽出開始しています。昨日数匹のマウスの大動脈（心臓より下〜肢の二股部分まで）の重量が5〜8mgでした。あまりにも少量なため、できるだけ全量回収を目指しています。 （質問タイトルからずれるのですが、アテロームの評価を血管の炎症とかで評価したく、血液だけでなく、組織のRNA,タンパクで評価できないものかとし王錯誤しています。） ところで、しまさまが血管を摘出されるのはどの部位でしょうか？胸部でしょうか？胸部は胃や肝臓などの臓器を除いたらきれいに見えますよね。そして、血管の胸側と背骨側に結合組織がついているのが見えるのですが、その両方をピンセットで除かれるのですか？つまんでちぎる感じにするのですか？また今日練習してみようと思いますので、またアドバイスお願いします。

(無題) 削除/引用 No.228-10 - 2009/03/26 (木) 09:17:33 - しま もしかして、胸部大動脈から腹大動脈まで、 一本で取る必要があるのでしょうか？ それでしたら、未経験ですので、手技的に あまり役立つアドバイスをすることができません。 ただ、血管を剥離するときに、はさみを使って おられるようなので、余分な組織がたくさん 付いて来てしまっているように思います。 はさみはどこでも切れますが、ピンセットなら 切れるべき（切れやすい）ところでしか切れません。 従って、まだ体にくっついている状態で、 血管をできるだけピンセットできれいにし、 はさみは最後に両端を切るときだけ使用するように してみてください。 そうすれば、摘出したときには、血管には ごく薄い膜のような結合組織しか付いて来ないので こすればちゃんと取れます。

(無題) 削除/引用 No.228-9 - 2009/03/25 (水) 22:26:13 - CJ おそレスですが、アルコール潅流固定は脱水が目的なので、100％なり、９５％なり、濃度の高いやつを使ってください。そうしたら血管の中の血液もなくなりますから、血液の除去も必要なくなって一石二鳥です。 ただ、アルコールはＲＮＡlaterと違って完全なRNase阻害は期待できません。手早くやるのはやっぱり大事でしょうね。 潅流固定はやったことありますか？一応やり方を書いておきますが、右心房を切って左心室から固定液（この場合アルコール）を注入します。マウスでしたら２０ｃｃ位でしょうか。

やってみました 削除/引用 No.228-8 - 2009/03/25 (水) 19:09:33 - あさひ ＞しまさま、genjiさま、 さっそくやってみました･･･ まず、二股に分かれているところを見つけ、両手に細いピンセットを持ちその周りの筋肉を横に除けていきました。血管を上にひっぱると背骨との間の隙間ができましたので、そこの薄い結合部分をピンセットで破き、横隔膜から心臓側の部分は、下部の血管をピンセットで持ち上げて血管と背骨との間を小さなはさみで切って分離して回収してきました。 しかし、結合組織はたくさんついたままです。 そして、お二人のおっしゃられたように、ろしを（今回は）PBSで湿らせ、その上にとってきた大動脈をのせ、はさみの背で軽く血液を出すようにこすってみました。すると、結合組織は横によるだけできれいに取れることはありませんでした。 その横によけたのをまたはさみで横に向けてこすって除くのでしょうか？ それにしても結合組織がありすぎで･･･きれいに除去しきるには至りませんでした…。 そしてろ紙も結構ぼろぼろになったのですが･･･ やり方がまずいのでしょうか？ とても困っています。 申し訳ありありませんが、またアドバイスを心からお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.228-7 - 2009/03/25 (水) 12:08:21 - しま 血管はチューブのままです。 血管の外側についている不要物を取り除くことが目的ですので、 ぐりぐりやりすぎてぼろぼろにしないように注意してください。 しかし申し訳ないのですが、血管のRNAや蛋白抽出は経験無いです。 自分の研究で、血管を速く夾雑物無く取る必要があるので、 主題の『マウス大動脈の摘出方法』についてのみのアドバイスです。 経験者であるgenjiさまの再登場を待ちましょう。

Re： 削除/引用 No.228-6 - 2009/03/25 (水) 11:49:33 - あさひ ＞genjiさま、 お返事ありがとうございます。 恥ずかしながらRNAlaterの存在を知りませんでした。N2で凍結しておいてから粉砕かなぁと思っていたところ、RNAlaterがあれば凍結せずにしばらく保存することもできるそうで、多少作業が遅くなっても大丈夫かなと安心しました。 ＞CJさま、genjiさま、 1つ質問なのですが、アルコールは何％何がいいのかも教えていただければ幸いです。

Re: 削除/引用 No.228-5 - 2009/03/25 (水) 11:32:21 - あさひ お返事ありがとうございます。 ＞CJさま、 前回の実験では、大動脈はOil red O染色だけ行いました。なので、外膜などに付着している脂肪や組織を除去していて随分時間が掛かりました。それにしても時間が掛かりすぎだと私も思います。もうちょっとスピーディーに行いたく思っています。 ＞しまさま、 ＞血管を撫でるようにし、血管内の血液を押し出すと同時に というのは、血管はチューブ上のままということでしょうか？切り開く必要はないのですか？腸管粘膜しか回収したことないのですが、このときは切り開いてスライドグラスでこそぎ取りました。 それと、1匹からどれくらいRNAを回収できるのでしょうか？ ウエスタンかPCRができればなと思っているので、もしよろしければ両方について（回収できるタンパクやRNA量）、どなたかアドバイスいただけると嬉しいです。サンプル量が足りないのか、作業中の容量の問題からなのか、3匹のマウスのサンプルをあわせて行ったという記述も見るので気になっています。

できます 削除/引用 No.228-4 - 2009/03/25 (水) 11:31:15 - genji しまさまの方法で私も摘出しています。 ＜番外編＞ 血液を十分に取り除きたい場合、氷冷したRNAlaterで急速潅流し、脱血させます。 あとは氷冷したRNAlater上で結合組織/脂肪組織などを綺麗にトリミングすれば大丈夫です。 RNAlaterではなく、CJさまの言うとおりアルコールでもよいと思います。

剥離してから摘出です 削除/引用 No.228-3 - 2009/03/25 (水) 10:56:40 - しま 腹大動脈から採血するときのように、開腹して血管を露出させ、 先の細いピンセットなどで剥離した後、両端を切断して摘出。 摘出したら生食で湿らせたろ紙の上で、ハサミの背を使って 血管を撫でるようにし、血管内の血液を押し出すと同時に 血管についてきた結合組織を剥がし取るときれいになります。 RNA抽出用ということなので、多少傷ついても問題ないでしょう。 慣れれば5分でイケると思います。

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