リンパ球の分離は結構難しいですよね。
私も以前の講座でやっていました。
そこでは、先が欠けていないパスツールピペットを
電動ピペットに装着して採取していました。
チップを用いると口径が大きいのと吸い上げる力の調節が難しいので
パスツールピペットよりも多くFicollを吸ってしまい
回収率が悪くなると考えます。
私の個人的な意見ですが、
回収率を高めるポイントは
@パスツールの先をFicollの層に入れない
AFicollまで吸い上げてしまうまたは境界面を乱すような力で回収しない
B欲張りすぎない
ことだと考えます。
特に、最初はAの力加減が難しいです。
これは、数をこなして感覚をつかむしかないと思います
Bに関してですが、いったんFicoll層に混ざってしまった
単核球は回収しない方が無難です。逆に回収率が悪くなります。
うまくなると、
薄い膜しか単核球層が残らないようになります。
うまかった人は、パスチールで円を書くように
均等に単核球層を回収していました。
> また、うちのボスはFicoll後の遠心操作で細胞が落ちないのは、残留Ficollが邪魔するからと、３−４倍培地で希釈した後、遠心回転数と時間を増やして(2000rpm 20min.)細胞を沈澱させています。しかし私はその後培養するので、1200rpm程度で遠心するためPBSで多めに希釈しようと考えています。皆さんはFicoll溶液中の細胞をどのように回収されておりますか？
>
> 不器用でお恥ずかしい限りですが、ご指導をお願いします。
細胞がダマにならない程度の遠心力で
時間を長くして遠心していました。
希釈倍率ですが、3−4倍の希釈倍率で十分です。
それ以上、希釈しても回収率は変わらないです。
私も、希釈倍率を上げれば落ちてくるかと考え、
希釈サンプルを遠心した際、浮いていた細胞の分画を
回収して再度培地で希釈し遠心したのですが
思うように落ちてきませんでした。
以上、参考になれば。 |
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