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リアルタイムＰＣＲのための逆転写酵素 トピック削除
No.25-TOPIC - 2009/02/13 (金) 12:42:04 - RT
ＡＢＩの機械でリアルタイムＰＣＲをすることになりました。反応は２ステップで行おうと思っています。これまで逆転写はSuperscriptIIを使っていましたが、最近は良いキットがいくつも出ているようなので、どれかを使ってみたいと思っています。そこで皆さんにお聞きしたいのですが、これはオススメというものや、これは少し問題があったというものはありますか？
　
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(無題) 削除/引用
No.25-15 - 2010/11/11 (木) 02:06:50 - tani
管理人さん、このNo25-13, 14の書き込みは

＞このフォーラムにふさわしくないと管理人が判断した投稿は予告なく削除します。

に該当すると思います、削除して下さいな。

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No.25-14 - 2010/11/11 (木) 01:37:19 - 人気唯一
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No.25-13 - 2009/10/27 (火) 14:30:14 - 高橋 美恵
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(無題) 削除/引用
No.25-12 - 2009/02/19 (木) 11:14:31 - RT
なるほどですね。
酵素の特性を考慮しながら、いくつかのものを比較してみたいと思います。
ありがとうございます。

(無題) 削除/引用
No.25-11 - 2009/02/18 (水) 23:39:10 - Pumpkin
【済】になっていて申し訳ないのですが、RocheのTranscriptor Reverse Transcriptaseをサンプルでもらって試してみたところ、結構よかったということを言うのを忘れていました。65℃でいけるということもいいのですが、比較的長鎖が得られにくいmRNAがあったのですが、これではほぼ完全長が得られたいうことがありました。

そば様が言われているように用途での使い分けも大事だと思いますが、こういう機会を活かしていくつかの酵素を使ってみて特性を感じておくと、いずれ役に立つかもしれません。

(無題) 削除/引用
No.25-10 - 2009/02/18 (水) 20:29:56 - カナマイシン
>T-2様
横やりですみません。
RTase反応後に、残存DNA-RNAハイブリッドに対して
RNaseH処理をしてやることで、そのRNAが分解されます。
そうしてやった方がその後のquantitive PCRの際に
より正しくcDNA量が計測できるはずです
（ハイブリッドを鋳型にしても増えないわけではないみたいですが
　やはり増えは悪くなるみたいです）。
曖昧な表記で申し訳ありませんが、感覚的におわかりかと思います。


>本論
SSと同じくInvitrogenのThermoscriptなんてどうですかね。
好熱菌由来のRTaseを改変したもので、
最高70度もの高温でRT反応ができます（反応最適温度はもう少し低い）。
70度ならコンタミRNaseのアタックも受けにくいのではないか、なんて少し期待します
（これはおまじない程度、というかギャグ？）。
GCリッチな生物だったりすると助かっているような気がします
（こっちが本筋。でも詳細な比較はしてないのでわかりません）。

SSIIにこだわってる人、私の周囲にもいました。
IIで立ち上げたマイクロアレイの再現性を取るためとのことでした。
ごもっともな意見だと思います。
だから今から新しい実験系を組むのであればIIIで
特に差し支えないのではないかと思います。
なんにせよ比較までしていないので断言できないところですが…

(無題) 削除/引用
No.25-9 - 2009/02/18 (水) 12:13:59 - T-2
そば様

後学のために教えてください。
＞特にリアルタイム用途であれば、RTaseにRNaseH活性が残っているものを選んだ方が検出レベルが上がるので良いかと

これはどのようなメカニズムなのでしょうか。

(無題) 解決済み 削除/引用
No.25-8 - 2009/02/18 (水) 10:16:52 - RT
ありがとうございます！

大変勉強になりました。

(無題) 削除/引用
No.25-7 - 2009/02/18 (水) 02:16:03 - そば
実際にどういう目的で実験を行うかによって、RTaseも使い分けるべきかと思いますよ。
基本的にはRNaseH活性が残っている酵素はリアルタイム用、RNaseH活性除去型酵素は遺伝子クローニング用でしょうね。


RTさんの尋ねられているHighCapasity cDNA Reverse Transcription Kitですが、私が使った限りでは「普通の逆転写酵素」です。
添付のdNTP濃度が異常に濃く使いづらい（確か100mMeachだった。数年前の話）などのデメリットはありますが、「ランダムプライマーで逆転写してリアルタイム」なら、価格や機器、試薬との相性等を考慮すると有力な選択肢であると思います。
特にリアルタイム用途であれば、RTaseにRNaseH活性が残っているものを選んだ方が検出レベルが上がるので良いかと（別個に処理すると余計なコストがかかる）。
RTさんの場合は「SSIIからの乗り換え＆リアルタイム用途」なので、個人的にはメリットが多い気がします。


一方で、SuperScript系は「高性能遺伝子クローニング用酵素」ですね。
SSIIとSSIIIの比較ですが、実際に大きな違いを感じることはほぼ無いです。「SSIIでなければいけない特別な理由（従来のサンプルとの統一性など。医学部に多い）」が無い場合は、迷うことなくSSIIIに乗り換えて良いのではないでしょうか。
また、高温で反応できるRTaseの中ではSSIIIが一番良い印象。GSPや特殊RT反応（RACE等）にはSSIIIが”安心”。ちなみに、SSIII以上の反応温度（耐熱性）を求めても、RNase inhibitorが失活するデメリットの方が大きい気がします・・・。
それと、SSIIはRT反応時のターミナルトランスフェラーゼ活性が残っているので、SMART法に使用することが可能（SSIIIはその活性が弱い）。実はこの違いが一番大きい気がする・・・。


ちなみに私はReverTraAce派だったりするのですが、これは「遺伝子クローニング用酵素」。
キャンペーン割引が多く、格安で高性能。dNTPが別売りなので、PCRで余ったdNTPを流用するとさらに格安。反応バッファーも別売り可なので、RT-の実験にも向いています。ただ、RNaseH-なので、リアルタイムの時には検出感度が若干落ちる（RNaseHを別途使用で改善可）。

PrimeScriptは私はほとんど使ってないのですが、普段からTAKARAの酵素を使う人なら上記のReverTraとほぼ同様の理由でお薦め出来そうな印象でした。


でまぁ、長々と書いてますが、ついでに。
QIAGENのQuantiTect RT kitは、面倒が嫌いな方にはお薦め。
上記の酵素類とは異なり、この反応バッファーのDTT濃度は低く、5xの反応バッファーに直接酵素を混ぜても失活しません（他の酵素は濃縮反応バッファー中で失活する恐れあり）。
プライマー、dNTPとRNAを混ぜて熱処理後、「バッファーと酵素を入れる」際に手抜きをして失敗する方にはお薦めですね。


ということで長々と書きましたが、個人的にはそんな印象。
最初にも書きましたが、用途で使い分け、が基本ですよ。

てか、この掲示板って、こういう質問のためにあるはずなんでしょうけど、なんでレスが少ないんですかねぇ・・・。

(無題) 削除/引用
No.25-6 - 2009/02/16 (月) 11:12:02 - RT
レス、ありがとうございます。
私も現在、ABIのキットを検討しています。HighCapasity cDNA Reverse Transcription Kit または HighCapasity RNA to cDNA kit です。SSに比べて安価であることと、リアルタイムPCRもABIのキットで行う予定だからです。
これらのキットを使用されている方、どうでしょうか？

Ambion 削除/引用
No.25-5 - 2009/02/16 (月) 11:08:23 - Pumpkin
RETROscript® First Strand Synthesis Kit for RT-PCRを使ってます。Ambion好きだというのもありますが、他のものと比較した感じでもそん色ないと思っています（比較検討したわけではないので、あくまで感じです）。

AmbionはABIのブランドですので、サポートも受けやすいと思います（この反応にサポートが必要かどうかという問題はありますが）。

(無題) 削除/引用
No.25-4 - 2009/02/16 (月) 10:50:58 - myu
私もRTさんと同じ事を検討しています。

このフォーラムなど検索させてもらったりしたのですが、Takaraのprimer script 1st standard cDNA Synthesis Kitもしくは、ABIのhigh capacity cDNA transcription kit にしようかと思っています。

まだ使用していない者の意見ですみません。

(無題) 削除/引用
No.25-3 - 2009/02/16 (月) 09:40:26 - SSII
便乗質問させてください。
私もラボではSSIIを使用しているのですが、SSIIIを使用している方、SSIIと比べて合成力等目に見えて変わっていますでしょうか？
invitrogenではSuperScript® II RTにポイントミューテーション を入れることで50℃での半減期が220分と格段に伸び、複雑な2次構造のあるRNAやより長いcDNA合成が可能。と謳っていますが。

値段も同じ為、新しい実験を組む段階から変更しようかと考えています。

SSIII 削除/引用
No.25-2 - 2009/02/16 (月) 05:57:00 - おお
それでもsuperscriptですね。IIIがでてますし。
それを長年使ってますし問題になったことがないので、、、

リアルタイムＰＣＲのための逆転写酵素 削除/引用
No.25-1 - 2009/02/13 (金) 12:42:04 - RT
ＡＢＩの機械でリアルタイムＰＣＲをすることになりました。反応は２ステップで行おうと思っています。これまで逆転写はSuperscriptIIを使っていましたが、最近は良いキットがいくつも出ているようなので、どれかを使ってみたいと思っています。そこで皆さんにお聞きしたいのですが、これはオススメというものや、これは少し問題があったというものはありますか？
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