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NB4細胞へのnucleofection トピック削除
No.270-TOPIC - 2009/04/02 (木) 20:52:29 - nucleofection
NB4細胞にnucleofector kit Vを用いてトランスフェクションを試みていますが，全くトランスフェクションされません．キット添付のpositive control (pmaxGFP)を用いるとうまくいくので，機会や試薬の問題ではないと思います．試したプラスミドはpIRES2-EGFP (5.3kb), phrGFP-N1 (4.3kb), pBABE-GFP (5.2kb)ですが，いずれもうまくいきません．プラスミドの量は推奨の2μgから10μgまでふってみましたがだめです．プラスミド抽出は，qiagenのmidi prepを用いて行っています．上のプラスミドをLipofectamine 2000をもちいてHeLa, HEKにトランスフェクションした場合，問題なくトランスフェクションされます．ポジコン(pmaxGFP) と上のプラスミド(pIRES2-EGFP) を混ぜてnucleofectionした場合，pmaxGFPはうまくトランスフェクションされるようでした（プラスミドを抽出したバッファにトランスフェクションを阻害するようなものが入っているという訳ではなさそうです）．なにか他に出来る事がありましたら教えていただけますか．どうぞ宜しくお願い致します．
　
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(無題) 削除/引用
No.270-2 - 2009/04/02 (木) 21:06:48 - 通りがかり
Transfection されていないのではなく、発現が低い＆蛍光が弱いので見えていないだけだと思います。IRES や SV40 promoter (pBABE) は一般に発現量はかなり低いですし、hrGFP は最近の明るい GFP バリアントに比べればかなり暗いです。しかしおそらく細胞内に入っているのは間違いないので、例えばウェスタンでもすれば検出できるかもしれません。

NB4細胞へのnucleofection 削除/引用
No.270-1 - 2009/04/02 (木) 20:52:29 - nucleofection
NB4細胞にnucleofector kit Vを用いてトランスフェクションを試みていますが，全くトランスフェクションされません．キット添付のpositive control (pmaxGFP)を用いるとうまくいくので，機会や試薬の問題ではないと思います．試したプラスミドはpIRES2-EGFP (5.3kb), phrGFP-N1 (4.3kb), pBABE-GFP (5.2kb)ですが，いずれもうまくいきません．プラスミドの量は推奨の2μgから10μgまでふってみましたがだめです．プラスミド抽出は，qiagenのmidi prepを用いて行っています．上のプラスミドをLipofectamine 2000をもちいてHeLa, HEKにトランスフェクションした場合，問題なくトランスフェクションされます．ポジコン(pmaxGFP) と上のプラスミド(pIRES2-EGFP) を混ぜてnucleofectionした場合，pmaxGFPはうまくトランスフェクションされるようでした（プラスミドを抽出したバッファにトランスフェクションを阻害するようなものが入っているという訳ではなさそうです）．なにか他に出来る事がありましたら教えていただけますか．どうぞ宜しくお願い致します．
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