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(無題) 削除/引用 No.272-14 - 2009/04/04 (土) 04:56:06 - 名無し その蛋白質の抗体あるなら、リン酸化されてるかどうかはプォスファターゼ処理やるやらないで２次元でWBやってスポットぱたん変わるかどうかみてみればわかる。ただクルードなサンプルをいきなりフォスファターゼ処理してはたしてどの位ちゃんと効くのかと言われると不安。ので、まずその蛋白質の抗体でIPやってそのIP物をフォスファターゼ処理したしないを２次元WBで比較するのが確実かも。そのあとその膜をすてないで抗体をしっかりストリップしてから今度は抗リン酸化修飾体抗体でもう一度検出してさっきのデータと画像重ねあわせればけっこういい感じのデータになるのでは。あと２次元のときの尿素は高純度品で新しいものを使い面倒でも用事調製で溶かしましょう。そうしないと尿素の分解物で蛋白質の一部が修飾されてアーティフィシャルな横方向の不連続スポットを生じる原因になり、結果の解釈がややこしくなることがある。 ごくプレリミナリーな実験はそんな感じでできるとおもうけど、修飾部位同定だとか本当の蛋白質化学的解析はMSMSみたいなのの助けを借りないとできないとおもう。またそれがどう変化するかとか定量的な解析は抗体で行ければいいけど、場合によってはサイラック法とかも利用する必要もでてくるとおもう。

免疫沈降→ProQ diamondに一票です 削除/引用 No.272-13 - 2009/04/03 (金) 23:25:29 - TS 抗リン酸化アミノ酸抗体は特異性の問題がありますので、First choiceとしてはどうかと思います。

(無題) 削除/引用 No.272-12 - 2009/04/03 (金) 17:09:51 - 通り まずはIPやってみて結果を見ないと始まらない気が。 あるタンパク質と結合しているリン酸化タンパクも検出するとか理屈をこねるのは 良さげな結果がでてからではないすかね。

(無題) 削除/引用 No.272-11 - 2009/04/03 (金) 16:38:46 - 中年 > リン酸化するペプチドに細胞抽出液とATPを混ぜて、ATPの残存量をルシフェラーゼでみるっていうキットもあるのですが、 それはキナーゼが決まっていないと使えないのでは？ また、使えるテクニックは問題とするタンパク質がどのくらい細胞から取れるかにも依りますよ。あべちゃん様、み様の挙げておられるリン酸化検出試薬は宣伝を見る限り感度があまり高くなさそうなので、CBBで見えるくらいの量無いとはっきり検出できないのではないかと思います。 PAGEのマトリクスと共有結合させられるPhos-tagという試薬があって、これだと検出はそのタンパク質自身に対する抗体を用いたウェスタンなので、使える抗体さえあれば感度は問題にならないでしょう。ホスファターゼ処理の有無で泳動度の変化を見ることになります。

(無題) 削除/引用 No.272-10 - 2009/04/03 (金) 15:44:58 - み ProQ Diamond Phospho Gel Stainなら特殊機器いらん。ググッてみい。

(無題) 削除/引用 No.272-9 - 2009/04/03 (金) 15:27:28 - あべちゃん phosphoQUANTI

(無題) 削除/引用 No.272-8 - 2009/04/03 (金) 15:15:32 - けい あまり詳しくないのですが、CIPやBAP処理した後でWBを行い、処理前と比べてバンドがシフトするかどうかをみるという論文をみたことがあります。

(無題) 削除/引用 No.272-7 - 2009/04/03 (金) 13:09:31 - とも お返事ありがとうございます。 やはりIPでやるのが一番ですかね。 最悪２次元してウエスタンかなって思っていました。 リン酸化するペプチドに細胞抽出液とATPを混ぜて、ATPの残存量をルシフェラーゼでみるっていうキットもあるのですが、それがリコンビナントタンパク質でワークするのかもわからないので、ちょっと躊躇していました。 どんな情報でもよいので他に何かあったら教えてください。

(無題) 削除/引用 No.272-6 - 2009/04/03 (金) 13:00:22 - 通りすがり そもそも、全く情報がないの状況では、取りあえず抗リン酸化チロシン抗体等でやるのが初手では？ ２次元しても、そのスポットが本当に目的のタンパク質かは、質量分析しない限りわからないのですから。 最初からする実験としてはキツすぎです。

既に実験法を決めた上で質問しているような… 削除/引用 No.272-5 - 2009/04/03 (金) 12:57:54 - ~ たまたま同じサイズのタンパク質が共沈してくるかどうかについて、 そこまで検討する必要があるのかと思いますけど。 そこまで気にするのでしたら、2D-PAGEでスポットが重なることも気になりますよね。 2D-PAGE後にスポットを切り出して、消化後にLC-MS/MSで配列を読んで、 目的のタンパク質の配列であることを確認し、リン酸化されているアミノ酸残基を同定してはいかがでしょうか。 既にとりあえずの実験ではなくなっていますが、 さすがにpI、分子量、一部のアミノ酸配列までが同じとなる、他のタンパク質の混入する可能性はとても低くなると思います。

(無題) 削除/引用 No.272-4 - 2009/04/03 (金) 12:41:30 - とも お返事ありがとうございます。 その方法だとあるタンパク質と結合しているリン酸化タンパクも検出しますよね？ 分子量でわかるかも知れませんが、もしかしたら結合しているリン酸化タンパクがあるとして、同じ分子量を示すかも知れませんので、直接的ではないと思ったのですが。 やはり２次元電気泳動などでやるしかないのですかね？

(無題) 削除/引用 No.272-3 - 2009/04/03 (金) 12:39:58 - 通りすがり あるタンパク質を免沈して 抗リン酸化チロシン抗体を使う 抗リン酸化セリン／スレオニン抗体を使う とか、常套手段かと。

(無題) 削除/引用 No.272-2 - 2009/04/03 (金) 12:36:48 - み ある蛋白を特異的に免疫沈降してWestern blotの1次抗体でanti-phosphoTyr,anti-phosphoSer/Theを使用する。

リン酸化 削除/引用 No.272-1 - 2009/04/03 (金) 12:22:13 - とも あるタンパク質がリン酸化を受けているかをみたいのですが、どこ部位、どのキナーゼでリン酸化されているかは全く情報がありません。 RIとかも使えないのですが、とりあえずリン酸化しているか否かをみたいときはどんな方法があるかやったことなある方いませんか？

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