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(無題) 削除/引用 No.279-17 - 2009/04/06 (月) 03:45:17 - おお >[Re:12] ろぼこんさんは書きました : > おおさんありがとうございます > > RNaseHはどうもシステムに含まれているようです > > 血液から取っているのは、humanのサンプルのため他の臓器は入手困難のためです。 > > 目的とする部位の5'端に近い部位で100bp程のPCRをかけてみたところ、増幅が見られているので全く目的のmRNAがないわけでないようなのですが、量としては少なそうです。 cDNAの購入を考えていらっしゃるので特に必要ないかもしれませんが、 白血球などでしたら、パ-コールなどをつかって、細胞を精製してから RNAを調製したほうが、きれいに取れると思います。 とれたRNAが10ugほどあるのであれば、1ugほど電気えいどうして、 rRNAを指標に分解が進んでないか確認する方がいいです。分解が 進んでいれば長いものはとれにくくなります。同時にスキルとして のチェックポイントですので、これを一つの指標とかんがえても いいかと思います。最近ではアジレントなどがキャピラリーで 微量で電気えいどうできるシステムを使うラボもあるかと おもいます(結構コストパフォーマンス悪いそうですが)。 > > ただ電気泳動で確認しただで、増幅産物をシークエンスにかけたわけではないので、本当に増幅されているかはわかりません。 > 得られている短いフラグメントは配列を確認するまでは 100%はっきりしませんが、制限酵素認識配列があれば それを使って、切れてバンドがシフトするか確認するても あると思います。よく切れる制限酵素を選ばないと いけないというのはありますが、、、 それとそのPCRフラグメント、ゲノム由来であることは否定できてますよね? 一応念のためのしつもんです。

ご指導ありがとうございます 削除/引用 No.279-16 - 2009/04/05 (日) 23:36:23 - ろぼこん みさんありがとうございます おっしゃるとおり、テクニックとして身につけておくべきことですし、トラブルシューティングの過程も大事なことであると思います 遺伝子工学については実験書しか相談できる相手がおらず、2-3週間一人で悩んでいたもので、今回ご助言いただき本当に助かりました ただ、入手可能なサンプル(血液)でのmRNAの発現が少ないという、根本的な問題があるため、次の手としては目的遺伝子が多く発現している臓器のcDNAライブラリの使用は検討しなければとは考えています。 目的遺伝子が多く発現している臓器のcDNAも紹介されたメーカーで売っていました、参考にさせていただきました、ありがとうございました

(無題) 削除/引用 No.279-15 - 2009/04/05 (日) 18:06:41 - み >[Re:14] RTで時間とお金をかけるよりもさんは書きました : > Open BiosystemsやInvitrogen, Promegaあたりのホームページにいって、 > そのcDNAが市販されているかどうかについては、確認しましたでしょうか？ > > IMAGEクローンの全長cDNAをかなりの確率で入手できます。 > 生資料から全長をクローニングするのは、万一トラブルがあるとスタックして > 面倒くさいです。 考え方は色々あるでしょうが、大学院生を訓練するために良い状況だと思います。今回の件が何キロのcDNAをクローニングしようとしているのか知りませんが、世の中のポスドクと称する人でも8kbを越えるサイズになるとお手上げ、または生試料からのクローニングをやったことがないというショボイ人を多く見かけます。将来的に考えて、得たいcDNA領域は必ず得られる腕を持っておくことは大事です。

(無題) 削除/引用 No.279-14 - 2009/04/05 (日) 16:31:30 - RTで時間とお金をかけるよりも Open BiosystemsやInvitrogen, Promegaあたりのホームページにいって、 そのcDNAが市販されているかどうかについては、確認しましたでしょうか？ IMAGEクローンの全長cDNAをかなりの確率で入手できます。 生資料から全長をクローニングするのは、万一トラブルがあるとスタックして 面倒くさいです。

nested PCR 削除/引用 No.279-13 - 2009/04/05 (日) 16:01:34 - ろぼこん みさん、ありがとうございます nestedPCR用にprimerをforward 1つ、revers 2つ注文したところです 手元にあるタグ付きのprimerと合わせて、ご指摘の通りの方法ができそうです さっそく今週実験してみようと思います アドバイスありがとうございました

ありがとうございます 削除/引用 No.279-12 - 2009/04/05 (日) 15:55:16 - ろぼこん おおさんありがとうございます RNaseHはどうもシステムに含まれているようです 血液から取っているのは、humanのサンプルのため他の臓器は入手困難のためです。 目的とする部位の5'端に近い部位で100bp程のPCRをかけてみたところ、増幅が見られているので全く目的のmRNAがないわけでないようなのですが、量としては少なそうです。 ただ電気泳動で確認しただで、増幅産物をシークエンスにかけたわけではないので、本当に増幅されているかはわかりません。 cDNAの購入は検討中してみます。 RTの反応時間の延長とステップアップサイクルは試してみようと思います。 具体的なアドバイスありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.279-11 - 2009/04/05 (日) 15:50:45 - み >[Re:8] ろぼこんさんは書きました : > > nested PCRのプライマーを設計し、その下流のprimer(20bp程度)をRTのプライマーとして使用しようと思いますが、それで大丈夫でしょうか? F1 F2 R2 R1 R3 ---------------------------------------------------------cDNA まずＲ３でRTかけて1st-PCRでF1-R1を使用。 nestedでF2-R2でかける。というのが一般的でしょうか。 しかし、すんなり行けるなら、R3でRTかけて1st-PCRでF2-R2で得たい部分を増やせると思います。この方が意外と綺麗にかかるかも。

(無題) 削除/引用 No.279-10 - 2009/04/05 (日) 15:36:01 - おお >[Re:9] おおさんは書きました : > ゲノムのその遺伝子(スタートコドンからストップまで)の > 長さはどれくらいでしょうか?もし数キロくらいなら、 > イントロン込みでゲノムから取った方がとりやすいかもしれません。 あ、イーストで使うんでしたっけ、、、それじゃあちょっと 直接はつかえないですね、、、細胞で過剰発現させといて mRNAをサイドcDNAにしないといけないし、、、、

(無題) 削除/引用 No.279-9 - 2009/04/05 (日) 15:30:37 - おお ネストとかはやってみる価値はあるとおもいます。 3種類ためしたわけですからこれを組み合わせて 2段階で増幅すれば良いわけですからすぐできますね。 cDNAをRNaseH処理すると改善することがありますが、 お使いのシステムの中に入っているかも知れません 一度後確認ください。 もう意見が出てますけど2ー3個所にわけて増幅でも いいとおもいます。配列が分かっているなら、制限酵素 で切れるところを利用してもつなげることができます。 この場合はオリゴdTのほかにランダムプライマーがつかえます。 あとはなぜ血液から取っているのでしょうか? それによってたの臓器から取るのがいいのか判断が違ってきます。 たしかに、よく発現している臓器から取る方がらくですが、、、 加えて、一般に組織から取るより、細胞などからRNAを精製したほうが 純度や質をコントロールしやすいです。 すでにクローンかされてプラスミドに入った状態で売られているものも かなりありますので、それを探す手もあると思います。 それか、パブリッシュされた文献から、クローン化した論文が見つかる ようでしたら、譲ってもらうのもいいかとおもいます。 RTの反応時間も長めにするというのも効くかもしれません。 昔は2時間反応して、さらに酵素を追加して2時間という こともよくやっていたと思います。 あと当然ですが、血液であまり発現してないというのは、 何によるものでしょうか?マイクロあれーで弱いけどシグナルがある というのであれば、見方によっては発現してないという判断も できますし、発現してないところからPCRしても取れませんから。 ゲノムのその遺伝子(スタートコドンからストップまで)の 長さはどれくらいでしょうか?もし数キロくらいなら、 イントロン込みでゲノムから取った方がとりやすいかもしれません。 選択的スプライシングがおこるなら、さらにもう１段階必要ですが、、、 単純にほかの酵素(PCRのポリメラーゼ)を使うというのも 選択肢です。 あとはタグツキプライマーだから最初の数サイクルは アニーリングの温度を低めにするかなぁ、、、これは 好みですけど。

参考になりました 削除/引用 No.279-8 - 2009/04/05 (日) 15:01:39 - ろぼこん アドバイスありがとうございます nested PCRと、RT時に遺伝子特異的プライマーの使用を行ってみようと思います。 nested PCRのプライマーを設計し、その下流のprimer(20bp程度)をRTのプライマーとして使用しようと思いますが、それで大丈夫でしょうか? それでだめならPCRの酵素を変えたいと思います。 どの酵素がよいかも聞ける人がいないので助かりました。

(無題) 削除/引用 No.279-7 - 2009/04/05 (日) 14:57:00 - み 失礼。御自分でnestedとspecific primerでのRTは記載されていましたね。 RT用はDNA配列で20merくらいで良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.279-6 - 2009/04/05 (日) 14:52:10 - み 酵素を変える。お勧めはprime starかFusion。 nested-PCRで行う。 RT-PCRのprimerをoligo-dTではなく、増やしたい対象遺伝子の3'領域にspecificなもので行う。 この3点を全て取り入れて無理なら、根本的に下手なのかもしれません。 訓練を要するでしょう。

すいません 削除/引用 No.279-5 - 2009/04/05 (日) 14:38:13 - ろぼこん 2-3個の部位にわけてPCRをかけ、最終的に全長部位を得る場合は PCR産物のアニールする部位はどれぐらいのbpにすればよいのでしょうか?

ありがとうございます 削除/引用 No.279-4 - 2009/04/05 (日) 14:18:19 - ろぼこん humanのサンプルが自前の血液しかないもので… コントロールのGAPDHはしっかりとバンドが出ているのでポジコンはとれています 2-3個の部分に分けてPCRをかけてみようと思います

(無題) 削除/引用 No.279-3 - 2009/04/05 (日) 13:34:32 - ~ >目的とする蛋白のmRNAは血球中では少ないことが知られています 目的とするタンパク質のmRNA量の多い組織、細胞を用いる。 >目的の5'端に近い部位で100bp程の部位をPCRして見たところ、バンドは薄いものの増幅が確認されました そのバンドをクローニングして、配列が正しいかを見ておく。 コントロールに増幅すると考えられるプライマーで増やしてみる。 Imagecloneなどでクローニング済みのものを買う。 全長を一度に増やそうとせず、2,3箇所に分けてPCRにかける。 �@、�Aはいいと思いますが、�Bはコストパフォーマンスが悪いと思います。

(無題) 削除/引用 No.279-2 - 2009/04/05 (日) 13:09:21 - 通りがかり ・PCR の酵素を変える ・cDNA クローンを買う

クローニングについて 削除/引用 No.279-1 - 2009/04/05 (日) 12:48:18 - ろぼこん 大学院2年目になります。 two hybridにて目的蛋白と相互作用する蛋白を検索しようとしていますが、目的遺伝子のPCRの段階で行き詰っています。 Laboにも遺伝子工学に明るいものがいないので、ここで質問させてください。 �@ humanの血液よりmRNAを採取(目的とする蛋白のmRNAは血球中では少ないことが知られています) �A Applide BioのReverse Transcription Regentsを使用しOlogo(dT)プライマーでRT �B プラスミドに導入するために付加配列をつけたprimerを使用し(35-40bp Tm 65-80)、clontechのAdvantage-GC cDNA PCR kitを使用してPCR、目的部位は約2kbp 電気泳動で目的のバンドがでません primerはすでに3種類程試しています サイクル数を増やしたり、PCR産物をもう一度PCRかけたりしましたが、だめでした cDNAに目的とする部位が入っているか確認するため、目的の5'端に近い部位で100bp程の部位をPCRして見たところ、バンドは薄いものの増幅が確認されました 今後、�@　RTで遺伝子特異的プライマーを使用する、�A nested PCRを行う　�B humanのcDNAライブラリーを買う(目的の蛋白がより多く発現している臓器のもの)を考えています。 現在の状態で�@-�Bの方法を試す価値はあるでしょうか、他にもっと良い方法はあるでしょうか? �@についてですが、逆転写反応のprimerのデザインの条件を教えてください。(何bp程度か、DNAのprimerと同じように設計してよいのか) �Bについて、どこのものがよいか教えてください 他、気づいたことをアドバイスしていただければありがたいです

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