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(無題) 削除/引用 No.3354-7 - 2010/10/17 (日) 12:16:30 - ノン 皆様 様々な返答ありがとうございます。 提案して頂いた実験系は、すぐにでも出来そうなので トライしてみたいと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3354-6 - 2010/10/15 (金) 04:49:13 - おお もう一つ安易に思いつくのはその遺伝子の違うポジションでshRNAを作ることです（お気づききかもと思って書きませんでしたが)。両者でkdと形質が一致していたらオフターゲットの可能性は低くなります。 場合によってはkdした下流の遺伝子を過剰発現し形質にリカバーがあるか示す手はあると思います(間接的でその下流のターゲットがどこまでソリッドかにもよるかもしれません、定石とまでは言えない方法ですが)。

こちらが参考になると思います。 削除/引用 No.3354-5 - 2010/10/15 (金) 04:47:31 - はまじ Ambionのサイト "Top Ten Ways to Ensure Valid RNAi Data" http://www.ambion.com/techlib/tn/112/15.html こちらはNature Cell biologyのEditorial "Whither RNAi?" http://www.nature.com/ncb/journal/v5/n6/full/ncb0603-490.html やはり一番強い証明方法は皆さん仰っているとおり、Gene AをノックダウンするshRNAに非感受性Gene A（サイレントミュータント、オルソログ、UTR無し等）の導入、それによる表現系のレスキューだと思います。 shRNA発現ベクターとのことですので、何らかのshRNA発現プラスミドを使用されていると思います。もしプラスミド内に薬剤耐性遺伝子の発現カセットがあれば、薬剤耐性遺伝子の部分をshRNA非感受性Gene A（コントロールとして"感受性"Gene Aもあると良いかもしれません）に入れ替えれば遺伝子導入の手間が軽減されるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3354-4 - 2010/10/14 (木) 21:51:57 - Actias スクランブルでなく、標的配列の真ん中２塩基とか３塩基（思いつきで適当な数字です)をいれたshRNAにするとか。 あとは、配列にとらわれず、「shRNAという名前の試薬のぶっ掛け実験」という観点も必要かと。

(無題) 削除/引用 No.3354-3 - 2010/10/14 (木) 18:42:40 - ノン おおさん ありがとうございます。 使用したshRNAにレジスタントなgeneAを導入することは 考えていました。やっぱりその方法で確認することでしょうか。 また、ターゲット配列はコーディング領域です。

(無題) 削除/引用 No.3354-2 - 2010/10/14 (木) 12:23:23 - おお geneAに対するsh RNAに非感受性なgene Aの発現によるshRNAの効果の消失 異種のオーそログとか、、、 UTRをターゲットにしているなら、UTRを含まない発現ベクターなど。

shRNAのOff Target Effect 削除/引用 No.3354-1 - 2010/10/14 (木) 10:25:10 - ノン いつもこの掲示板にはお世話になってます。 現在、vivoおよび初代培養細胞に、geneAに対するsh RNA発現ベクターを導入し、実験をしています。主に、表現型解析をし、コントロールとしてスクランブルまたはLacZに対するsh RNA発現ベクターを用いてます。 解析を行っていると、表現型に差があることが確認できました。 そこで、質問なのですが、この表現型が使用したshRNAのOff Target Effectである可能性を排除するにはどのような実験系があるのでしょうか？ 現在使用しているsh RNA発現ベクターは１種類です。もっと種類を増やさなくてはいけないことは承知しておりますが、よいターゲットが見つかっていないのが現状です。 ご教授の程、よろしくお願いします。

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