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(無題) 削除/引用 No.3392-5 - 2010/10/21 (木) 18:09:29 - Pumpkin >そこまでわかっている材料なら、adaptor-primerなんか使わず最初からgene-specific primerがデザインできそうですが。 APさんがおっしゃるように目的の遺伝子が決まっていればそうですよね。取りたい遺伝子がたくさんあるから、発現遺伝子全体を逆転写しておいて、釣りたいものの上流特異的プライマーでpolyA tailまで取りたいのだろうと思っていました。ORFだけでなくてpolyA付加サイトも決めたいとか。

(無題) 削除/引用 No.3392-4 - 2010/10/21 (木) 17:45:31 - おお マンマルとかだと、T7をつなげてさらにすこしエクステンションした ものを使っているのがありますね。 モレキュラークローニングにもそのようなものがのってなかったかなぁ。 けっこうむかしからやられる方法で文献とかにでも書いてあったりします。

(無題) 削除/引用 No.3392-3 - 2010/10/21 (木) 17:28:05 - AP >生物種が決まっていて、かつその生物種のゲノムが公開されていればその中でblastをかけて引っかからなければいいんではないでしょうか。 そこまでわかっている材料なら、adaptor-primerなんか使わず最初からgene-specific primerがデザインできそうですが。 >polyT配列の5'端にAdaptor primerと呼ばれるPCR用のプライマーの配列を配置し という形のadaptor primerではないですが、ClontechのMarathonやTakaraのRACEシステムのようにdouble-strand cDNAを合成してからligationで両末端にprimer annealing sequenceのアダプターを付ける方法でよいなら、配列やマニュアルは公開されています。 これらの方法の優れているところは、すべてのcDNA分子のアダプターからプライミングされるのではなく、gene-specific primerからアダプターまで伸長した鎖からのみアダプターからのプライミングが起こるようになっていることです。 逆転写プライマーにアダプター配列を付けておくより、いろいろな面でメリットがあると思います。

(無題) 削除/引用 No.3392-2 - 2010/10/21 (木) 16:07:20 - Pumpkin 生物種が決まっていて、かつその生物種のゲノムが公開されていればその中でblastをかけて引っかからなければいいんではないでしょうか。そのようなソフトウエアは知らないので、適当に作った方が早いような気がします。 これでは全然アドバイスになっていないので少し提案してみると、RACE法の各社キットのprimer配列を参考にするというのが良いのではないでしょうか。私はCLONTECHを愛用していますが、その他にもTakara Full RACE core set、invitrogen RACEシステム等があります。基本的にoligo dTについてるアダプタープライマーは公開されていると思います。

Adaptor primer 削除/引用 No.3392-1 - 2010/10/21 (木) 13:20:10 - real-time いつもお世話になっております。 polyT配列の5'端にAdaptor primerと呼ばれるPCR用のプライマーの配列を配置し、逆転写後のPCRびよる増幅に用いる論文（かマニュアル）を見たことがありますが、どのようにAdaptor primerの配列を決めているのかご存知の方いましたらお教えください。できれば自作したく思い、プライマー作成支援ソフトウエアで何とかしようと思って探していますが、いまだ見つかりません。もしソフトウエアでAdaptor primerを作った方がいましたら、タイトルを教えていただければ幸いです。 よろしくお願いします。

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