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Xgal染色 トピック削除
No.3406-TOPIC - 2010/10/24 (日) 22:05:29 - ぼんすけ
実験初心者です。
現在腸管に対するXgal染色に苦しんでおり、皆様のお知恵をいただきたいと思い投稿いたしました。

１．腸組織を還流固定後、OCTコンパウンドに包埋。
２．クライオスタットで薄切して、リンスバッファー（PBS＋MgCl2+NP40+Deoxycholate Na）で洗浄。
３．撥水性のペンで組織を囲み、新しいリンスバッファーにXgal、フェロシアン化カリウム、フェリシアン化カリウムを混ぜたものを切片に載せ、37℃のオーバーナイトで発色。
４．洗浄し、核染色　→　エタノール　→　キシレン　→　包埋

という流れでやっております。
撥水性のペンとしてDAKOペン or スーバーバップペンを使用しているのですが、オーバーナイトでの発色中に溶けてしまい、発色液がなくなり、標本が乾いてしまいます。37℃という温度に加えて、発色液中のNP40がペンを溶かしてしまっているのかもしれません。

色々な発色液のプロトコールを見ると、NP40やDeoxycholate Naを省いて、PBS+MgCl2+Xgal+フェロ+フェリでやっている方もおられるようですが、省いても染色には問題ないのでしょうか？　他、ペンが溶けない工夫など何かあるものでしょうか？　何かと不勉強で申し訳ありませんが、経験のある方からご意見が頂ければ助かります。よろしくお願いいたします。
　
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(無題) 解決済み 削除/引用
No.3406-6 - 2010/10/29 (金) 23:52:32 - ぼんすけ
お返事遅れました。
JJさん、ありがとうございます。
おかげさまで色々と勉強させていいただきました。
参考にさせていただき、色んなパターンを試してみたいと思います。
またお世話になるかもしれませんが、よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用
No.3406-5 - 2010/10/26 (火) 01:39:38 - JJ
先に発色させる利点としては、Wholeで観察できる、パラフィンブロックを作れる、切片を切ってすぐに発現細胞を確認できる、といった点が挙げられます。欠点は発色液の量が多くなること、腸粘液に発色液が反応してバックグラウンドが出ることです。具体的な染色法はNature 333, p852 (1988)、腸管ならPNAS 93, p9588 (1996)を参考にしてください。前者は高感度、高バックグラウンド、後者は低感度、低バックグラウンドになります。

感度に関しては切片で発色させた方が高感度というのが通説ですが、おそらく組織に発色液が浸透しにくいのではないかという感覚的な説だと思います。腸管のような薄い臓器ではそれほど問題にならないでしょう。

ありがとうございます。 削除/引用
No.3406-4 - 2010/10/25 (月) 19:28:11 - ぼんすけ
皆様、ありがとうございます。
このサイトに投稿したのは初めてなのですが、参考になるご意見をすぐにいただけて感謝しております。

JJさん。そんなペンがあるんですね！！
是非購入し、試してみようと思います。
条件を振っての検討についてはおっしゃる通りです。臓器を先に染めてから、切片を作るというのはやったことがないのですが、プロトコールとしては順番を変えるだけ（固定→Wholeで発色液中にオーバーナイト→OCTに包埋して切片作成）でいいのですか？？
この場合、LacZが相当強く発現していないと、発色が弱くなるのかな、というイメージなのですが、問題ないのでしょうか？
不勉強で申し訳ないのですが、教えていただければ嬉しいです。


JHさん。その方法は他の免染でも抗体を節約する上で有用だと聞いたことがあります。実際にやったことはないのですが、是非tryしてみます。

(無題) 削除/引用
No.3406-3 - 2010/10/25 (月) 13:50:37 - JH
私も密閉された湿箱は使っていますが、撥水性のペンは使っていません。スライドより若干小さめに切ったパラフィルムを用意し、発色液をスライドに載せた後、かぶせてあげてください。37℃で一晩程度であれば、それで乾かずに済みます。パラフィルムがカールしている場合、出来るだけ伸ばして平らにしてやらないとムラができます。

(無題) 削除/引用
No.3406-2 - 2010/10/25 (月) 07:36:03 - JJ
密閉された湿箱に入っていて染色液の量が十分であれば、撥水ペンが溶けても完全には乾燥しないはずです。とはいえ、PAP penは確かに熱やdetergentに弱いのでVector社のImmEdge Hydrophobic Barrier Penをお薦めします。

反応液のdetergentあり、なし、反応温度の違い（4、30、37度）によって感度やバックグラウンドが変わってきますので、撥水ペンの問題は別にして色々な条件でベストの結果が得られるよう検討されてみてはどうでしょうか。個人的には臓器を先に染めてから切片を切った方が失敗が少ないと感じます。

Xgal染色 削除/引用
No.3406-1 - 2010/10/24 (日) 22:05:29 - ぼんすけ
実験初心者です。
現在腸管に対するXgal染色に苦しんでおり、皆様のお知恵をいただきたいと思い投稿いたしました。

１．腸組織を還流固定後、OCTコンパウンドに包埋。
２．クライオスタットで薄切して、リンスバッファー（PBS＋MgCl2+NP40+Deoxycholate Na）で洗浄。
３．撥水性のペンで組織を囲み、新しいリンスバッファーにXgal、フェロシアン化カリウム、フェリシアン化カリウムを混ぜたものを切片に載せ、37℃のオーバーナイトで発色。
４．洗浄し、核染色　→　エタノール　→　キシレン　→　包埋

という流れでやっております。
撥水性のペンとしてDAKOペン or スーバーバップペンを使用しているのですが、オーバーナイトでの発色中に溶けてしまい、発色液がなくなり、標本が乾いてしまいます。37℃という温度に加えて、発色液中のNP40がペンを溶かしてしまっているのかもしれません。

色々な発色液のプロトコールを見ると、NP40やDeoxycholate Naを省いて、PBS+MgCl2+Xgal+フェロ+フェリでやっている方もおられるようですが、省いても染色には問題ないのでしょうか？　他、ペンが溶けない工夫など何かあるものでしょうか？　何かと不勉強で申し訳ありませんが、経験のある方からご意見が頂ければ助かります。よろしくお願いいたします。
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