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酵素反応実験 トピック削除
No.3507-TOPIC - 2010/11/11 (木) 11:31:07 - mairo
現在酵素反応の、基質濃度と酵素濃度、反応時間、反応生成物量の関係について予備実験を行っているのですが、今回のGCF(臨床サンプル)の場合は酵素濃度がサンプルに依存するため、十分量な基質濃度を決定し、その濃度で一定にした際の反応生成物量と時間のグラフを作成し、すべてのサンプルにおいて反応速度がゼロ(右上がりの直線が横ばいになる)になるまで行い、
その結果を用いて差を評価しようと考えております。

おかしな点があればご指摘いただければと思います。
 
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(無題) 削除/引用
No.3507-23 - 2010/11/17 (水) 20:13:12 - mairo
非常に参考になりました。
ありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.3507-22 - 2010/11/14 (日) 20:13:57 - himawari
こういうのは反応初速度で評価するのは適切なんですか?
シグモイドになったり多段階反応する可能性がありますから、全体的なプロフィールを調べるべきです。

私ならタイムコース等を適当にふってkineticsをおおまかに調べて、グラフが直線的になる部分(EC50〜EC70ぐらい)で評価しますね。
5alpha-reductaseとかはEC70ぐらいでやったかなぁ。
そんなに難しく考える必要ないと思います。
inhibitorをつくる予定だったら、IC50を出すと思うんですけど、だいたいEC50〜EC70ぐらいで調べますよ?

(無題) 削除/引用
No.3507-21 - 2010/11/14 (日) 19:11:54 - 00
> 迷っていたのは過去の論文に初速度で評価しているか微妙な反応時間で
> 結果をだしている報告があるからです。

先行論文に関して、ぱっと見の判断で無視するのは危険なように感じます。

というか、オーサーにメール書いて問い合わせてみることはできないの?

(無題) 削除/引用
No.3507-20 - 2010/11/14 (日) 05:27:02 - か
比較の基準はどうすればいいか、という話ですよね。

せめて、product/mg protein/minのような単位時間、タンパク質量当たりの産物産出量を出さないと行けない訳ですが、単位時間当たりを出すには、反応初期の、反応系がほとんど変化していないところで測定する訳です。その結果、KmやVmaxが計算されて、その値を持って比較するのが理想と思われます。

血清とか全細胞抽出液のような、純品では無い場合、見かけのKm、Vmaxと言うことになるとおもいます。せめて、product/mg protein/minです。

(無題) 削除/引用
No.3507-19 - 2010/11/12 (金) 20:56:31 - mairo
ただ複数の酵素が効いている可能性が高い場合でもKm、Vmaxを出す意味はあるのでしょうか?

(無題) 解決済み 削除/引用
No.3507-18 - 2010/11/12 (金) 19:47:39 - mairo
ありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.3507-17 - 2010/11/12 (金) 18:48:10 - 小言幸兵衛
> 迷っていたのは過去の論文に初速度で評価しているか微妙な反応時間で
> 結果をだしている報告があるからです。

初速度を評価していると見なして良い反応時間かどうかは、アプリオリには判断できないのではありませんか。

仮に貴方が仰るとおりであったとしても、世の中には駄目な論文は山ほどあるわけですし、他に理由がないならその論文にそこまで拘泥しなくとも良いように思います。

(無題) 削除/引用
No.3507-16 - 2010/11/12 (金) 18:10:35 - か
KmとVmaxを計算する場合、産物が直線的に増加する短い時間内で、基質の濃度を振って、ミカエリス・メンテン型かどうかを調べ、Lineweaver-BurkプロットでKmをVmax計算するのが、最初のアプローチかと。

(無題) 削除/引用
No.3507-15 - 2010/11/12 (金) 08:59:28 - mairo
精度で考えれば初速度ですね。

迷っていたのは過去の論文に初速度で評価しているか微妙な反応時間で
結果をだしている報告があるからです。

今回は目的とする基質を切断する体液中のトータルの酵素活性を評価したいのです。

(無題) 削除/引用
No.3507-14 - 2010/11/12 (金) 01:42:15 - おお
着地点をきいたのは、検体(組織)がどの程度の活性を持っているのか調べるのか、組織に発現するその活性を担うタンパク質の活性を調べるのかです。

要するにトータルの蛋白ベースの解析か、その蛋白ベースで数字が欲しいのかでアプローチが違ってくると思いますがいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.3507-13 - 2010/11/11 (木) 23:26:26 - TS
まだ悩まれているのですね。。。

むしろ逆にお聞きしたいのですが、
なぜエンドポイントにこだわるのでしょうか?

エンドポイントでは時間もかかるし、精度も悪い。
良いことありますか?

おそらく学生さんだと推測しますが、先生にお聞きしてみては?

(無題) 削除/引用
No.3507-12 - 2010/11/11 (木) 22:56:23 - mairo
やはり反応初速度で比較するのが適切なのでしょうか?

(無題) 削除/引用
No.3507-11 - 2010/11/11 (木) 19:26:54 - ザンギ
着地点が見えませんが...
エンドポイントで初速度を測定することは出来ない...というか、測定したとは主張できないと思いますが、その程度の測定で試料間の差が見れればOKという
ことならありでしょう。

(無題) 削除/引用
No.3507-10 - 2010/11/11 (木) 18:59:34 - 小言幸兵衛
それを「反応初速度」と言います。

(無題) 削除/引用
No.3507-9 - 2010/11/11 (木) 18:51:15 - mairo
> 十分に一定量の基質が存在し、仮に酵素が失活しないのであれば、
> エンドポイントの反応生成物はほぼ同じ量になると思います。

 その通りだと思います。

> なので、酵素活性を知りたいという目的ですので、枯渇しないだけの十分量の基質を入れておき、反応が進んでいる途中で止めれば(右肩上がりに反応生成物ができている時間)、酵素量を定量できることになると思います。

差がでるのはすべてのサンプルが右肩あがりの際に反応を止めれば
酵素活性が定量できるわけですね。
つまりそこで反応を止めた際の単位時間あたりの反応生成物量が
酵素活性になると。

(無題) 削除/引用
No.3507-8 - 2010/11/11 (木) 17:47:49 - TS
想像しましょう。

トピ主さんの実験系において反応速度が0になるのは、基本的には基質が枯渇したとき、あるいは反応生成物によるフィードバック阻害がかかったときではないですか?
(もちろん酵素が失活して、それ以上反応が進まない、という状況もあるわけですが、今はそれは考えないとして。)

十分に一定量の基質が存在し、仮に酵素が失活しないのであれば、
エンドポイントの反応生成物はほぼ同じ量になると思います。

なので、酵素活性を知りたいという目的ですので、枯渇しないだけの十分量の基質を入れておき、反応が進んでいる途中で止めれば(右肩上がりに反応生成物ができている時間)、酵素量を定量できることになると思います。

>現在酵素反応の、基質濃度と酵素濃度、反応時間、反応生成物量の関係について予備実験を行っているのですが、

このあたりは、どういうことを意味しているのか、いまいちわかりませんが。

要は、酵素活性を定量したいのですよねぇ??

(無題) 削除/引用
No.3507-7 - 2010/11/11 (木) 17:37:01 - mairo
エンドポイントアッセイで行うのもありでしょうか?

(無題) 削除/引用
No.3507-6 - 2010/11/11 (木) 14:59:16 - ザンギ
アッセイ反応が進むことによって基質の濃度が変わったり、プロダクトによる
阻害があったり、時間経過にともなって酵素が失活したりする事があるので、
反応開始初期の短い時間で反応物の生成速度を測定するのが一般的かと思って
おります。

(無題) 削除/引用
No.3507-5 - 2010/11/11 (木) 13:50:58 - mairo
酵素活性の定義を単位時間当たりの反応生成物の量と認識
していたのですが、誤りでしょうか?

今回の実験では、サンプル中にはさまざまな特定できないプロテアーゼが含まれており、どの程度サンプル間で反応生成物に差がでるかをみたいのですが、適切な評価方法が決定できないでおります。

過去の同一の内容の文献では生成量で差を見ていました。

(無題) 削除/引用
No.3507-4 - 2010/11/11 (木) 12:31:43 - ザンギ
>その結果を用いて差を評価しようと考えております。

プラトーになるまでの時間ですか。
プラトーになった時の分解物の量ですか。
いずれにしろいろんな要素が関わってきて上記の要素ではうまく評価できない
ので、普通は反応初速度をもって酵素活性とすると思います。

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